همسانه سازي، بيان و تخليص بخش خارج غشايي پروتئين Tir از باكتري E.coli O157:H7 و ارزيابي ساختاري آن

Cloning, Expression and Purification of the Outer Membrane of Tir Protein from E.coli O157: H7 and Evaluation its Structure

سابقه و هدف باكتري اشرشياكلي انتروهموراژيك (Enterohemorrhagic E. coli) سويه­ ي O157:H7 يك پاتوژن مهم انسان و حيوان است كه در انسان موجب بروز اسهال خونريزي دهنده و سندروم اورمي هموليتيك مي شود. اتصال به سلول­هاي ميزبان اولين گام در تثبيت اين باكتري است كه به واسطه­ي سيستم ترشحي نوع (T3SS) III و از طريق ميان­كنش بين پروتئين­هاي ترشحي صورت مي­گيرد. Tir پروتئيني است كه پس از بيان در باكتري و از طريق T3SS به سلول ميزبان منتقل و در غشاي آن مستقر مي شود و نقش مهمي در اتصال باكتري به ميزبان دارد. هدف از اين تحقيق ساخت سازه ژني است كه داراي فاكتورهاي ويرولانس Tir مي­باشد. مواد و روش­ ها: : طراحي پرايمر اختصاصي براي ژن tir با استفاده از نرم افرازOligo انجام شد و تكثير ژن به وسيله واكنش PCRاز روي DNA الگو صورت گرفت. پس از واكنش­هاي هضم آنزيمي و الحاق ژن درون ناقل بياني pET28a ، انتقال ناقل به درون ميزبان بياني انجام شد. پس از تاييد همسان­سازي ژن، بيان نوتركيب پروتئين Tirبا استفاده از القاگر IPTG صورت گرفت. براي تاييد پروتئين Tir آناليز وسترن بلات انجام شد. يافته‌ها: : همسان سازي ژن tir درون وكتور pET28a به شكل مناسب بين جايگاه­هاي مطلوب انجام شد و پروتئين Tir پس از القا، پروتئين نوتركيب بيان مناسب و قابل توجهي نشان داد. آنتي بادي مورد استفاده در وسترن بلات نيز توانست به شكل مناسبي Tir را شناسايي كند. نتيجه‌گيري: در اين مطالعه، سازه پايدار محتوي ژن tir ساخته شد كه بيان نوتركيب قابل توجهي از پروتئين Tir را از خود نشان داد. بنابراين اين سازه را مي توان براي توليد پروتئين Tir جهت مطالعات ايمني زايي عليه E.coli O157:H7 به كاربرد..

Aim and Background: Enterohemorrhagic E. coli O157: H7 is an important human and animal pathogen that causes hemolytic uremic hemorrhagic diarrhea in humans. The binding to host cells is the first step in stabilizing this bacterium through the secretion system of the type (T3SS) III and through the interactions between secretory proteins. Tir is a protein that is transferred to the host cells after expression in the bacterium and via T3SS and is located in the membrane and plays an important role in the bacterial binding to the host. The purpose of this research is to clone a gene construct that has Tir virulence factors.