نقش مهاري آنزيم فورمات دهيدروژناز در رشد باكتري صنعتي BL21

Inhibitory role of formate dehydrogenase enzyme in the growth of BL21 industrial bacteria

سابقه و هدف: متابوليسم بالا در حضور اكسيژن با سرعت رشد سريع در طيف وسيعي از ارگانيسم‌ها از جمله باكتري‌ها، مخمرها و يا سلول‌هاي سرطاني رخ مي‌دهد. توانايي رشد با راندمان بالا نقش مهمي در بيوتكنولوژي به­ويژه در طي فرآيند توليد پروتئين‌ها (به­طور ترجيحي نوتركيب) و يا تركيب­هاي متابوليك مانند اسيدهاي آلي و متابليت­ هاي ثانويه ايفا مي‌كند. افزايش راندمان رشد باكتري­ها به­ ويژه باكتري اشرشياكلي كه موتور فعاليت­هاي تحقيقاتي و صنعتي است هدف آرماني در بيوتكنولوژي ميكربي است. در اين تحقيق بر آن شديم تا با بررسي مسيرهاي متابوليكي E. coli راهكاري براي كاهش ميزان CO2 توليدي و در نتيجه افزايش راندمان توليد توده سلولي از مواد آلي در فرآيند رشد و تكثير پيدا كنيم. مواد و روش-ها: مسيرهاي متابوليكي مستند شده در وبگاه KEGG با ديدگاه كاهش راندمان توليد CO2 از اسيد فرميك بررسي شد. دو سويه باكتري ناك اوت شده با منشاء K12 از بانك ميكروبي Keio تهيه شد. سپس، سويه­ هاي منتخب در محيط كمپلكس (LB) و ساده (M9+Glycerol) كشت داده شدند. ميزان توليد توده سلولي در تيمارهاي مختلف با اندازه­گيري جذب نوري در 600 نانومتر با يكديگر و هم­چنين با سويه استاندار BL21 مقايسه شدند. نتايج: در محيط پيچيده LB، موتان باكتري­هاي اشرشيا (W3866 و W4040.) نسبت­به BL21 از رشد بيش­تري (در حدود 5 برابر درساعات 8 و 10 ساعته و 3 برابري در زمان 12 ساعته نسبت­به نمونه­ هاي داراي ژن فورمات دهيدروژناز) برخوردارند. البته اين تفاوت در محيط ساده M9 بارزتر بود به ­طوري­كه رشد بيش از 6 برابري در زمان 24ساعت از انكوباسيون در نمونه­هاي موتان فاقد ژن فورمات دهيدروژناز نسبت­به سويه مادر BL21 مشاهده نموديم. بحث: آزمايش­ها با پيش­بيني­هاي متابوليكي به­طور كامل مطابقت داشت و رشد باكتري­هاي موتان از باكتري BL21 بيش­تر بود. نكته جالب توجه رشد بيش­تر موتان­ها در محيط ساده حاوي گليسرول بود كه نشان داد گليسرول منبع به­طور كامل مناسبي براي رشد باكتري اشرشياكلي است. اين نتايج دلايل عدم تطابق پيش ­بيني­ هاي مدل­هاي متابوليكي قبلي كه گليسرول را يك منبع كربن مناسب براي رشد E. coli اعلام كرده بود، ولي در عمل به آن دست نمي ­يافت، را توضيح مي­دهد. نتيجه­ گيري: در شرايط فيزيولوژيكي نرمال E. coli قادر به رشد بالايي در محيط گليسرول نيست، حذف ژن فورمات دهيدروژناز در آن سبب تغييرهاي اساسي در روند متابوليسمي و افزايش چند برابري رشد در مقايسه با سويه بياني BL21 گرديد كه بيانگر نقش اين آنزيم در جلوگيري از افزايش راندمان رشد E. coli در حضور گليسرول است. به ­علاوه از سويه حاصل مي­توان در بيان پروتئين­هاي نوتركيب با راندمان بالاتر استفاده نمود.

Aim and Background: High metabolism occurs in the presence of oxygen with rapid growth rate in a wide range of organisms including bacteria, yeasts or cancer cells. The ability to grow at high yields plays an important role in biotechnology, especially during the production of proteins (preferably recombinant) or metabolic compounds such as organic acids and secondary metabolites. Increasing the growth efficiency of bacteria, especially Escherichia coli, which is the engine of research and industrial activities, is a noble goal in microbial biotechnology. In this study, we sought to find a solution to reduce the amount of CO2 produced and thus increase the production efficiency of cell mass from organic matter in the process of growth and proliferation by examining the metabolic pathways of E. coli. Materials and Methods: Metabolic pathways documented on the KEGG site were examined with a view to reducing the CO2 production efficiency of formic acid. Two strains of knockout bacteria of K12 origin were obtained from Keio microbial bank. Then, selected strains were cultured in complex (LB) and simple (M9 + Glycerol) media. Cell mass production in different treatments were compared with the standard BL21 strain based on optical absorption at 600 nm. Results: In the LB complex medium, Escherichia coli mutants (W3866 and W4040) grew faster than BL21 (approximately 5-fold at 8 and 10 h and 3 times at 12 h compared to samples with the dehydrogenase formate gene). However, this difference was more pronounced in the simple M9 medium, as we observed more than 6-fold growth in 24 hours of incubation in mutant samples lacking the FDH gene compared to the BL21 maternal strain. Discussion: The experiments were completely in line with metabolic predictions and the growth of mutant bacteria was higher than that of BL21. Interestingly, most mutants grew in a simple medium containing glycerol, which showed that glycerol is a very good source for the growth of Escherichia coli bacteria. These results explain the inconsistency of predictions of previous metabolic models that declared glycerol a suitable carbon source for the growth of E. coli, but did not achieve it in practice. Conclusion: Under normal physiological conditions, E. coli is not able to grow high in glycerol medium. Deletion of formate dehydrogenase gene caused fundamental changes in metabolic process and increased growth rate compared to BL21 strain, which indicates the inhibitory role of this enzyme in increased growth efficiency of E. coli in the presence of glycerol. In addition, the resulting strain can be used to express recombinant proteins with higher efficiency.