خالص سازي لاكتوفرين جداشده از شيرگاو بوسيله كرماتوگرافي تمايلي

Purification of lactoferrin isolated from cow's milk by affinity chromatograph

لاكتوفرين يك پروتئين چند عملكردي با خاصيت ضدميكروبي است كه خواص متنوع و شگفت آوري داردو مي‌تواند كانديد مناسبي جهت كاربرد‌هاي باليني و تجاري باشد.در اين بررسي جهت جداسازي لاكتوفرين ابتدا پروتئين‌هاي قسمت آب پنيري شير با استفاده از روش كروماتوگرافي تعويض يوني توسط CM sephadex C-50 خالص و جهت تاييد خالص سازي ، از آزمايش SDS-PAGE و نيز عدم ايجاد رنگ در حضور تترامتيل بنزدين استفاده شد. در ادامه خرگوش سفيد نر نيوزلندي با µg/ml120 لاكتوفرين و با استفاده از ادجوانت كامل و ناقص فروند به مدت 6 هفته ، ايمن شد وپس از جدا سازي سرم با آزمايش هاي دات بلات و الايزا آنتي بادي اختصاصي تاييد گرديد. جهت خالص سازي آنتي بادي اختصاصي از روش رسوب دهي با سولفات آمونيوم 40 درصد استفاده گرديدكه پس از تاييد به سفارز فعال شده با سيانوژن متصل گرديد، قسمت آب پنيري آغوز گاو از ستون كروماتوگرافي تمايلي عبورداده شد.بمنظور خالص نمودن لاكتوفرين، براي تشكيل كمپلكسي از آنتي ژن آنتي بادي واكنش داده و در نهايت ساير تركيباتي كه اتصال نيافته‌اند شسته شده وخارج مي گردند.خالص سازي لاكتوفرين تاييد و غلظت آن با آزمايش برادفورد محاسبه گرديد.نتايج تحقيق نشان داد كه روش ايمن نمودن، جهت توليد آنتي بادي اختصاصي بر عليه لاكتوفرين روشي مناسب بوده و خالص سازي لاكتوفرين ازشيرگاو با استفاده از كروماتوگرافي تمايلي داراي بازده 64 درصد مي باشد.

Lactoferrin is a multifunctional protein that has various and amazing properties with antimicrobial properties ,can be a good candidate for clinical and commercial applications. Lactoferrin was purified by ion exchange chromatography using CM sephadex C-50 and to confirm the purification, SDS-PAGE tests and the absence of dye in the presence of tetramethylbenzene were used In this study, in order to isolate lactoferrin, first the whey proteins of milk using ion exchange chromatography by Sephadex C-50 was purified and SDSPAGE test was performed to confirm the purification as well as no dye in the presence of tetramethyl benzidine. New Zealand white male rabbits were immunized with 120 µg / ml lactoferrin and using complete and incomplete Freund’s adjuvant for 6 weeks and after serum isolation were confirmed specific antibodies by dot blot and ELISA. To purify of the specific antibody, the precipitation method with 40% ammonium sulphate was used. After confirmation, it was attached to cyanogen-activated Sepharoz. The whey portion of bovine colostrum was passed through the affinity chromatographic column. In order to purify lactoferrin, it reacts to form a complex of antibody antigens, and eventually other unbound compounds are washed and removed. Purification of lactoferrin was confirmed and its concentration was calculated by Bradford test. The results showed that the immunization method was used to produce specific antibodies against Lactoferrin is a suitable method and purification of lactoferrin from bovine milk using affinity chromatography has an efficiency of 64%.