بهينه‌سازي و ارائه دستورالعمل استخراج و باززايي پروتوپلاست سيب‌زميني و تراريختي آن

هدف: ويژگي‌هاي منحصر بفرد پروتوپلاست‌هاي گياهي، آن‌ها را به ابزاري قدرتمند براي محققين، جهت مطالعه تغييرات ژنتيكي سلولي تبديل كرده است. مهمترين پيش نياز استفاده از پروتوپلاست‌ها، توانايي استخراج ساده در مقادير بالا، كشت و باززايي آن‌ها جهت تشكيل كلوني سلولي و توليد گياه است. معمول‌ترين روش استخراج پروتوپلاست از بافت‌هاي گياهي، روش آنزيمي است. غلظت و تركيب آنزيم‌ها و مراحل جداسازي و كشت، از عوامل كليدي استخراج پروتوپلاست مي‌باشد. هدف اين تحقيق، بررسي اثر فاكتورهاي مذكور بر روي پروتوپلاست‌هاي گياهان درون‌شيشه اي سيب‌زميني (Solanum tuberosum L.) و معرفي روشي كارا و مناسب براي استخراج، تراريختي و كالوس‌زايي/باززايي از اين گياه است. مواد و روش‌ها: براي جداسازي پروتوپلاست سيب‌زميني رقم رايج تجاري آگريا، تيمارهاي مختلف غلظت آنزيم‌هاي سلولاز و مسروزيم، مدت نگهداري در محلول آنزيمي و مراحل جداسازي بر روي بافت برگ، ساقه و بخش‌هاي هوايي گياهچه‌هاي درون‌شيشه اي و اثر غلظت هورمن‌هاي مختلف بركشت و باززايي پروتوپلاست مورد بررسي قرار گرفت. پس از جداسازي، كارآيي تراريختي پروتوپلاست‌ها به‌واسطه ي PEG 4000 با استفاده از ناقل pBin61GFP ارزيابي شد. نتايج: بهترين نتايج از ريزنمونه‌هاي برگي و بالاترين تعداد پروتوپلاست (106 × 2 پروتوپلاست بر ميلي ليتر)، پس از 16 ساعت نگهداري در محلول آنزيمي (حاوي 1 درصد سلولاز و 0.2 درصد مسروزيم) از بافت‌هاي مزوفيل برگ حاصل شد. كارآيي تراريختي پروتوپلاست‌ها به واسطه ي PEG با غلظت 40 درصد و مدت زمان 30 دقيقه ،50 درصد بود. بهترين تيمار محيط كشت براي القاي كالوس‌زايي، محيط MS حاوي 5 ميلي‌گرم بر ليتر NAA و 0.1 ميلي‌گرم بر ليتر BAP بدست آمد كه در اين تيمار هورموني، 100 درصد پروتوپلاست‌ها بعد از حدود يك ماه كالوس تشكيل دادند. بهترين تيمار باززايي از كالوس تركيب هورموني 2 ميلي‌گرم برليتر Zeatin با 0.1 ميلي‌گرم بر ليتر GA3 به همراه 0.01 ميلي‌گرم بر ليتر NAA با راندمان 86 درصد بود. نتيجه‌گيري: بر اساس نتايج حاصل، دستورالعمل استخراج پروتوپلاست و انتقال ژن توصيف شده در اين تحقيق براي مهندسي ژنتيك، انتقال و بيان ژن در گياه سيب‌زميني كارآيي لازم را دارد.