بيان و تخليص آنزيم Cas9 در باكتري E. coli

ويرايش ژنوم مبتني بر فناوري CRISPR/Cas9 (كريسپر) به عنوان ابزار قدرتمندي براي اصلاح گياهان زراعي بسرعت در حال گسترش است. يكي از مزاياي اين فناوري امكان دستورزي ژن هاي هدف بدون درج DNA خارجي در گياه است. براي اين منظور نياز است كه آنزيم Cas9 و RNA  راهنما بصورت كمپلكس پروتئين-RNA (RNP) به سلول گياهي منتقل شود. از اينرو توليد Cas9 در آزمايشگاه مقدمه آزمايشات كريسپر مبتني بر RNP است.هدف اين پروژه بيان و تخليص آنزيم Cas9 در باكتري E. coli مي باشد. در اين پژوهش ژن Cas9 در ناقل بياني pBADM30 كلون و به باكتري  E. coliسويه ي CodonPlus منتقل شد. بيان Cas9 با اعمال 2/0 درصد L-Arabinose  القا شد و سپس از كل پروتئين محلول جداسازي شد. سپس آنزيم Cas9 توسط با استفاده از ستون ميل تركيبي نيكل تخليص شد. حضور Cas9  در پروتئين كل و پروتئين تخليص شده با استفاده از الكتروفورز SDS-PAGE تاييد شد. نتايج حاصل از كلوني PCR و هضم دوگانه ي آنزيمي وجود ژن Cas9 در ناقل pBADM30 را تاييد نمود. نتايج  SDS-PAGE حضور پروتئين با وزن ملكولي حدود 180 kDa را در پروتئين كل نشان داد. همچنين وجود يك تك باند با وزن ملكولي حدود 180 kDa در دو فرگشن بافر شستشو ي حاصل ار رزين نيكل نشان داد كه پروتئين هدف به درستي تخليص شده است. آنزيم Cas9 در باكتري  E.coli  با موفقيت بيان و تخليص شد. با توجه به نتايج به دست آمده مي توان  گفت كه پس از سنجش فعاليت كاتاليكي آنزيم Cas9 مي توان از اين آنزيم به همراه  RNA راهنما و ساخت كمپلكس RNP و انتقال آن به گياه با روش پروتوپلاست يا الكتروپوريشن در پژوهش هاي بعدي استفاده كرد