همسانه‌سازي، توالي‌يابي و بررسي بيان ژن C4H در آنغوزه تلخ Ferula pseudalliacea

سابقه و هدف: آنغوزه تلخ Ferula pseudalliacea گياهي از خانواده چتريان، چند ساله و مونوكارپيك مي‌باشد. رويشگاه اين گياه آسياي مركزي تا نوار شمالي اروپا مي‌باشد. تركيبات اصلي تشكيل دهنده متابوليت‌هاي ثانويه اين جنس شامل كومارين‌ها، سزكوئي‌ترپن‌ كومارين‌ها و دي‌سزكوئي‌ترپن‌كومارين‌ها مي‌باشد. با توجه به تركيبات موجود در اين گياه از گذشته‌هاي دور توسط مردم بومي در طب سنتي به صورت گسترده استفاده شده است. مسير اصلي بيوسنتز تركيبات موثر اين گياه مسير فنيل‌پروپانوئيد است. يكي از آنزيم‌‌هاي اصلي و كليدي اين مسير سينامات -4- هيدروكسي لياز است. هيچ اطلاعات ژنومي از ژن‌هاي اين گياه دارويي با ارزش وجود ندارد و به‌عنوان اولين گزارش ، ژن C4H از اين گياه همسانه و توالي‌يابي شد و ميزان بيان آن در ريشه، ساقه، برگ، گل آذين و بذر نارس مورد بررسي قرار گرفت.مواد و روش‌ها: قسمت‌هاي مختلف گياه Ferula pseudalliacea در اوايل خردادماه از جنوب شرقي روستاي گزنه در 20 كيلومتري سنندج جمع‎‌آوري گرديد. استخراج RNA از بافت هاي مختلف گياه Ferula pseudalliacea با روش ليتيم كلريد انجام گرفت. جهت سنتز cDNA ، از كيت سنتز cDNA شركت يكتا تجهيز در حجم 20 ميكروليتر استفاده شد. محصول پي سي آر با استفاده از آغازگر طراحي شده از نواحي حفاظت شده ژن C4H، درون ناقل pTG19 همسانه شد. نمونه‌هاي پلاسميد نوتركيب بعد از تاييد مولكولي ، جهت تعيين توالي به شركت آپلايد بيوسيستم ارسال شد. جهت ارزيابي ميزان بيان ژن‌ C4H از دو روش واكنش زنجيره‌اي پليمراز در زمان واقعي و روش نيمه كمي استفاده شد. دندروگرام داده‌هاي به دست آمده از توالي‌يابي هر ژن، با استفاده از نرم‌افزار مگا با روش آماري اتصال همسايگي با ميزان بوت سترپ براي توالي پروتئيني رسم شد.يافته‌ها: توالي‌هاي به دست آمده از كلون‌هاي ژن C4H در پايگاه داده ان سي بي آي با استفاده از BlastX همرديف شد و با توجه به نتيجه بلاست، توالي هاي دو ژن ذكر شده تاييد گرديد. اين ژن با ژن‌هاي C4H ساير گياهان هم خانواده خود در يك گروه قرار گرفت. اين ژن بالاترين تشابه را در هر دو سطح توالي نوكلئوتيدي و پروتئين با ژن C4H هويج نشان داد كه با هم در يك زير گروه قرار گرفتند. ژن C4H داراي 7 موتيف بوده كه موتيف حفظ شده سيتوكروم سيستئين P450 با توالي FGVGRRSCPG در خانواده سيتوكروم P450 جز آنها مي‌باشد. بررسي بيان ژن با واكنش زنجيره‌اي پليمراز در زمان واقعي بالاترين سطح رونويسي را در گل‌آذين و كمترين ميزان بيان را در برگ نشان داد.نتيجه‌گيري: C4H به عنوان دومين ژن كليدي مسير فنيل‌پروپانوئيد نقش انكارناپذير در توليد تركيبات فنلي در بافت‌هاي ويژه همانند گل‌آذين كه بيشترين ميزان بيان را نشان داد، دارد. ساير پژوهش‌هاي انجام شده درگياهان مختلف در زمينه بيان ژن C4H نشان از اختصاصي عمل كردن در توليد تركيب‌هاي خاص، در بافت خاصي بوده است. با توجه به اينكه تركيبات فنلي دامنه وسيعي از متابوليت‎هاي ثانويه را به صورت مواد فرار (اسانس) و عصاره شامل مي‌شود براي پي بردن به نقش دقيق آنزيم C4H در اندام‌هاي مختلف نياز به تحقيق بيشتر مي‌باشد. با توجه به نقش انكارناپذير ژن C4H در بيوسنتز بسيار از تركيبات با ارزش دارويي، از توالي شناسايي شده مي‌توان در توليد تركيبات نوتركيب در ساير گونه‌هاي گياهي كه پيش‌ماده‌هاي مورد نظر را دارند، استفاده نمود.