بهينه سازي روش HRM-Real Time PCR براي تشخيص كرم قلب

مطالعه اكولوژي انگلهاي سگ هاي ولگرد از اهميت زيادي برخورداراست. باتوجه به امكان انتقال انگل هاي مشترك از سگ هاي ولگرد به انسان، اين انگل ها از جمله خطرات بالقوه جوامع انساني امروز محسوب مي شود كه نياز به مطالعات جامع دارد. ديروفيلاريا ايميتيس انتشار جهاني دارد و ايران يكي از مناطق اندميك براي اين آلودگي است.ازاين رو، تحقيق حاضر با هدف بررسي آلودگي به ديروفيلاريا ايميتيس در سگ ها ي ولگرد استان هاي گيلان، قزوين وما زندران با استفاده از روش HRM Real -Time PCR و مقايسه آن با روش PCR معمولي انجام شد. مهمترين سوال تحقيق اين بود كه: آيا روش HRM Real -Time PCRقادر به تفريق گونه هاي فيلرهاي آلوده كننده سگ در ايران و همچنين قادر به تشخيص عفونت مخفي است؟به اين منظوردر بررسي حاضر، نمونه خون هاي حاوي ضد انعقاد از 138 قلاده سگهاي ولگرد در استانهاي گيلان، مازندران و قزوين با روش مولكولي مورد ارزيابي قرار گرفتند. دراين مطالعه قسمتي از ژنcoxI ديروفيلاريا ايميتيس (به طولbp 256 ) تكثير گرديد. روش HRM Real -Time PCRبا استفاده از دستگاه روتورژن انجام شد. نتايج مطالعه حاضر نشان داد كه در مجموع از 138 نمونه جمع آوري شده ازسه استان گيلان، مازندران و قزوين با روش PCR معمولي وHRM Real -Time PCR 8/47 % از نمونه ها مثبت شدند. در مطالعه حاضر حساسيت روش PCR وHRM Real -Time PCR100 % حاصل شد (حساسيت و ويژگي براساس روش استاندارد طلايي PCR و تعيين توالي قطعه هاي تكثير شده، محاسبه شد)ويژگي هردوروش 100% است. نتايج HRM Real -timePCR نشان داد كه PCR براساس ژن coxI انگل قادر به تشخيص آلودگي است. نمونه هايي كهPCR مثبت بودند، داراي ميانگين دماي ذوب ºc 66/ 76بودند ، اين توالي ها در سطح نوكلئوتيد اختلاف 2-1 % داشتند، اما ترجمه اين توالي ها به اسيد آمينه تشابه 100% نشان داد، به عبارت ديگر دماي ذوب قادر به تفريق 2-1%اختلاف درسطح نوكلئوتيد بود. اما در نمونه هاي مورد بررسي در مطالعه حاضر اختلافي در سطح گونه ديروفيلاريا ايميتيس يا احتمال سويه زايي مشاهده نشد. نتايج مطالعه حاضر نشان داد كه به منظور تشخيص آلودگي سگها به ديروفيلاريازيس لازم است روشهاي ملكولي بكارگرفته شوند و روش HRM Real-TimePCR كه مبتني برتغييرات دماي ذوب ناشي از اختلاف در سطح نوكلئوتيد ها است، مي تواند به منظور تفريق گونه فيلر آلوده كننده استفاده شود