ارزيابي اثر مايع رويي ‌كشت سودوموناس آئروژينوزا بر رفع اثر مهاركنندگي هپارين در آزمون Real-TimePCR

زمينۀ مطالعه: هپارين يك گليكوزآمينوگليكان سولفاته است. خون يك منبع متداول براي رديابي DNA موجود در انواع نمونه‌ها مي‌باشد كه براي جلوگيري از انعقاد آن از ضد انعقادهايي چون هپارين و  EDTAاستفاده مي‌شود. هپارين به علت داشتن اثر مهاركنندگي شديد برروي PCR در نمونه‌هايي كه قرار است مورد رديابي DNA قرار بگيرند، بكار نمي‌رود. جهت حذف اثر مهاري هپارين بر آزمون PCR، روش‌هاي فيزيكي، شيميايي و آنزيمي وجود دارد. هدف: مطالعه حاضر ابتدا با هدف مقايسه شدت اثر مهاركنندگي دو ضد انعقاد هپارين وEDTA  بر Real-TimePCR(qPCR)، سپس بررسي اثر آنزيم هپاريناز موجود در عصاره محيط‌كشت باكتري سودوموناس‌ آئروژينوزا بر رفع اثر مهار‌كنندگي هپارين طي‌ Real-TimePCR صورت گرفت.روش‎كار: در مطالعه حاضر ابتدا دو نمونه خون هپارينه و EDTAدار جهت بررسي شدت اثر مهاركنندگي مورد آزمون Real-TimePCR قرار گرفتند. سپس در ادامه به نمونه خون هپارينه آلوده به باكتري اشيرشياكلي در‌ دو گروه با شرايط مختلف، عصاره محيط كشت باكتري سودوموناس آئروژينوزا اضافه شد. در گروه اول ابتدا DNA موجود در نمونه خون هپارينه، توسط روش فنول-كلروفرم ايزوآميل ‌الكل استخراج شد. سپس‎ گرمخانه‌گذاري اين نمونه‌ها با عصاره محيط‌كشت باكتري سودوموناس ‌آئروژينوزا در ساعات مختلف صورت گرفت، اما درگروه دوم، نمونه‌ها قبل‌ از استخراج DNA، در ساعات مختلف گرمخانه‌گذاري شدند. همچنين غلظت DNA موجود در هر دو گروه توسط دستگاه نانودرآپ انداز‌ه‌گيري شد و در نهايت تمام نمونه‌ها مورد آزمون Real-TimePCR قرارگرفتند.نتايج: تجزيه ‌و تحليل نتايج حاصل از نمونه‌هاي مورد پژوهش نشان داد كه نمونه خون هپارينه با وجود اين‌كه غلظت DNA بيشتري را نسبت به نمونه خون EDTAدار شامل مي‌شود، اما به‌طور كامل مانع تكثير ژنوم ‌مي‌شود. همچنين تيمار خون هپارينه به همراه عصاره محيط‌كشت باكتري سودوموناس ‌آئروژينوزا قبل از استخراج DNA به مدت زمان بيشتر از 24 ساعت، موجب رفع اثر مهاري هپارين طي‌ آزمون Real-TimePCR، حتي در چرخه آستانه (CT:Cycle thershold) پايين‌تر از نمونه EDTAدار مي‌شود.نتيجه­گيري نهايي: استفاده از عصاره محيط‌كشت باكتري سودوموناس آئروژينوزا ممكن است محققين را قادر سازد، بتوانند بدون نياز به استفاده از آنزيم هپاريناز تجاري گران‌بها و محدود، از نمونه خون هپارينه در راستاي تقويت و تشخيص ژنوم استفاده كنند.