همسانه سازي، و بررسي بيان ژن Mannose-6-phosphate reductase (M6PR) گياه كرفس در باكتري اشرشياكلي جهت كنترل مسير كاتابوليسم

هدف: اطلاعات كمي در مورد متابوليسم قند و نحوه ادغام آن با ساير مواد، در مقايسه با ساير محصولات فتوسنتزي اوليه (مانند ساكارز و نشاسته) وجود دارد. Mannose-6-phosphate reductase (M6PR) يك آنزيم كليدي است كه در بيوسنتز مانيتول در كرفس نقش دارد. هدف از اين پژوهش  همسانه سازي ژن، بررسي بيان ژن و تخليص آنزيمM6PR  و بررسي عملكرد آن بر روي ژن هاي جهش يافته در محيط آزمايشگاهي بوده است. مواد و روش‌ها: ابتدا  استخراج mRNA از گياه كرفس انجام شدو سپس سنتز cDNA صورت گرفت و محصول به عنوان الگو در تكثير ژن M6PR  مورد استفاده قرار گرفت..محصول PCR توسط كيت استخراج DNA از روي ژل، تخليص شد. محصول PCR خالص شده مطابق با دستور العمل T/A Cloning (فرمنتاز) در ناقل pTZ57R همسانه سازي شد. سلول مستعد E.coli سويه Top10 با استفاده از روش بيوشيميايي كلريد كلسيم تهيه شد و وكتور نوتركيب درون آن ترانسفورم و روي پليت حاوي آمپي سيلين كشت داده شدند. صحت كلونينگ با استفاده از PCR ژن M6PR  و هضم آنزيمي پلاسميد نوتركيب توسط آنزيم هاي BamHI, SacI (شركت فرمنتاز) انجام گرفت.  سپسژن M6PR  در پلاسميد بياني pET32a  همسانه سازي شد و درون باكتري E.coli سويه BL2I انتقال داده شد. پيشبر ژن با IPTG القا شد و با وسترن بلاتينگ مورد بررسي قرار گرفت.  پروتئين توليد شده با ستون كروماتوگرافي تمايلي (His.Tag/S.Tag) تخليص شد. نتايج: نتايج نشان دادند كه آنزيم مي تواند نواحي هترودوبلكس ژن را شناسايي كند. M6PR  نوتركيب خالص شده از اشريشيا كلي،داراي فعاليت خاص مولكولي بود. نتايج حاصل از هضم دوگانه پلاسميد با آنزيم هاي SacI و BamHI، قطعات 2870 جفت بازي و 186 جفت بازي بود. قطعه حاضر مطابق با نتيجه ازمون بلاست شباهت 100درصدي با ژن M6PR گياه كرفس داشت. نتايج بررسي رونويسي ژن نوتركيب M6PR نشان داد كه ميزان رونويسي ژن نوتركيب M6PR در سويه هاي تراريخت برابر با 3/2 و در كنترل 32/0 به دست آمد كه تفاوت معناداري در سطح P 0.01 را از نظر آماري نشان دادند. پس از القاي پيشبر و نمونه برداري در زمان هاي مختلف، نمونه ها روي ژل SDS-PAGE باند پروتئيني در ناحيه 42 كيلو دالتون را نشان داد كه نشان دهنده بيان پروتئين به صورت موفقيت آميز بود.نتيجه‌گيري:  همسانه سازي ژن آنزيمM6PR  بدست آمده از گياه كرفس و به دنبال آن توليد اين آنزيم به صورت نوتركيب در آزمايشگاه مي تواند منجر به بيان بالاي  آن در سيستم پروكاريوتي  شود به طوريكه آنزيم داراي فعاليت  باشد. همچنين مطالعه حاضر نشان داد كه آنزيم هاي گياهي وقتي در باكتري بيان مي شوند، فعال مي باشند و مي توانند به عنوان منبع مناسب براي تسريع فعاليت كاتابوليك استفاده شوند.