طراحي سازه ژني فيتاز ايكولاي و فيتاز آسپرژيلوس نايجر و بيان آن در مخمر پيكيا پاستوريس به‌منظور افزايش تجزيه فيتات گياهي

هدف: فيتازها براسـاس اولين كربني كه در حلقه ميواينوزيتول فسـفات در فيتات دفسـفريلاسيون شروع مي شود به گروه هاي ۳ فيتازها (E.C. 3.1.3.8) ، ۶ فيتازها (E.C. 3.1.3.26) و ۵ فيتازها (EC 3.1.3.72) طبقه بندي مي شوند مخمرها با داشتن ويژگي هاي زيادي ازجمله دستكاري ژنتيكي آسان، بيان بالاي پروتئين هاي برون سلولي و درون سلولي و توانايي انجام اصلاحات پس ازترجمه اي متناسب با سلول هاي يوكاريوتي، براي بيان پروتئين هاي خارجي مناسب هستند. مخمر متانول دوست پيكيا پاستوريس براي توليد پروتئين هاي نوتركيب در تراكم سلولي بالا و محيط كشت ارزان، توسعه يافته است. بنابراين بيان همزمان دو آنزيم دريك ميزبان بياني نوتركيب سودمند خواهد بود. هدف ازاين مطالعه ساخت وكتور نوتركيب حاوي ژن هاي فيتاز ايكولاي از خانواده ۶ فيتاز و فيتاز آسپرژيلوس نايجر از خانواده ۳ فيتاز به منظور افزايش تجزيه فيتات و بيان همزمان آنها در مخمر پيكيا پاستوريس بود.روش: توالي نوكلئوتيدي ژن هاي آنزيم فيتاز ايكولاي ، (appA2) فيتاز آسپرژيلوس نايجر ، (phyA) لينكر 2a و سيگنال پپتيد آلفا فاكتور از پايگاه داده NCBI دريافت گرديد. در اين پژوهش ژن هاي فيتاز ايكولاي و آسپرژيلوس نايجر كه بوسيله لينكر 2a بهم متصل شده بودند در پلاسميد PIC9K طراحي و براي سنتز به شركت Genescript آمريكا فرستاده شد. پس از دريافت پلاسميد سنتز شده كه حاوي ژن هاي مورد نظر بود اين سازه ژني در باكتري DH5a كلون شد و پس از برش با آنزيم SacI در مخمر پيكيا پاستوريس الكتروترنسفرم شد. تحريك بيان ژن با استفاده از متانول در غلظت نهايي نيم درصد در دماي 30 درجه سانتيگراد صورت گرفت. نمونه‌گيري هر۲۴ ساعت انجام شد و ميزان توليد پروتئين نوتركيب بااستفاده از الكتروفورز بررسي گرديد. يافته ها: نتايج حاصل از كلوني PCR نشان داد كه وكتور مورد نظر با موفقيت در باكتري DH5a ترانسفرم شده است و نتايج حاصل از PCR نشان داد كه پلاسميد با موفقيت وارد مخمر شده است. فيتازappA و فيتاز phyA با موفقيت در مخمر پيكيا پاستوريس بيان شد. وزن مولكولي فيتازهاي نوتركيب توليد شده در حدود ۴۵ و ۸۰ كيلو دالتون به ترتيب براي فيتاز appA و فيتاز phyA تخمين زده شد. فعاليت آنزيم نوتركيب توليد شدهU/ml 160.97 بود.نتيجه گيري: به منظور توليد مكمل آنزيم فيتاز نوتركيب، ژن هاي هدف دروكتور بياني pPIC9k طراحي و سنتز شد و وكتور نوتركيب پس از تكثير در باكتري اشرشيا كليDH5α وارد ژنوم مخمر پيكيا پاستوريس به عنوان ميزبان بياني شد. اين سازه ژني براي انجام آزمايشات بعدي (آزمايشات مزرعه اي) استفاده خواهد شد.