ايجاد رده سلولي پايدار جهت توليد فسفوليپاز نوتركيب A2 زهر زنبورعسل (آپيس مليفرا)

زمينه مطالعه: زهر زنبور عسل داراي تركيبات پيچيده‌اي مانند پلي‌پپتيدها، آنزيم‌ها و آمين‌ها مي‌باشد. از اجزاي مهم زهر زنبور عسل، آنزيم فسفوليپازA2  است كه به‌‌عنوان يك آلرژن مهم زهر زنبور عسل مطرح مي‌باشد و در درمان برخي از بيماري‌ها كاربرد دارد. اين آنزيم در حشرات ديگر، آراكنيدها، مارها و سلول‌هاي پستانداران يافت مي‌شود و عملكرد آن هيدروليز پيوند استري دوم گليسروفسفوليپيدها و آزاد شدن اسيدهاي چرب و ليزوفسفوليپيدها مي‌باشد. پروتئين‌هاي نوتركيب توسط ترانسفكشن موقت قابل‌‌توليد مي‌باشند، اما جهت توليد در مقياس بالا با صرفه اقتصادي، سلول‌هاي پايدار مناسب‌ترند.هدف: مطالعه حاضر باهدف ايجاد رده سلولي پايدار جهت توليد فسفوليپاز نوتركيب A2 زهر زنبورعسل (آپيس مليفرا) انجام شد.روش‎كار: وكتور PCDNA حاوي ژن فسفوليپاز  A2از كمپاني ماكروژن تهيه شد. پلاسميد نوتركيب با روش شوك حرارتي به سلول‌هاي CHO منتقل شد و بيان ژن در محيط كشت HamsF12 حاوي آنتي‌بيوتيك نئومايسين صورت گرفت. پس از ازدياد رده‌هاي پلي‌كلونال حاوي پلاسميد، كلون‌هاي مونوكلونال توسط روش رقت محدود  (limiting dilution)انتخاب شدند. سپس اقدام به تكثير كلون‌هاي مونوكلونال، جمع‌آوري و تغليظ سوپ سلول‌هاي انتخاب‌‌شده گرديد و با انجام آزمايش SDS-PAGE بيان پروتئين مذكور ارزيابي شد.نتايج: نتايج الكتروفورز كه جهت تأييد بيان ژن فسفوليپازA2  در سوپ سلول‌ها انجام شد يك باند با وزن مولكولي 20 كيلودالتون را نشان داد كه مؤيد ايجاد رده سلولي پايدار جهت توليد فسفوليپاز A2 نوتركيب زهر زنبور عسل است.نتيجه­گيري نهايي: پس از ترانسفكشن موقت پلاسميد حاوي اين ژن، تعدادي از سلول‌هاي حاوي پلاسميد به‌واسطه داشتن سازوكارهاي ترميمي دچار نوتركيبي شدند و ژن مورد‌نظر همراه با ژن مقاومت به آنتي‌بيوتيك را در ژنوم خود قرار دادند كه با اضافه‌ كردن آنتي‌بيوتيك به محيط كشت مي‌توان اين سلول‌ها را انتخاب كرد و سپس به بسط و تكثير آن‌ها پرداخت.