ساخت مولكول هيبريدي پروتئين- آپتامر با استفاده از كونژوگاسيون مستقيم براي استفاده در روش الازاي مبتني بر آپتامر

سابقه و هدف: آپتامرها مولكول‌هاي (DNA) Deoxyribonucleic acid يا(RNA) Ribonucleic acid  تك‌رشته‌اي هستند كه به دليل دارا بودن ميل پيوندي و اختصاصيت بالا براي مولكول‌هاي هدف و برتري‌هايي نسبت به آنتي‌بادي‌ها مورد توجه قرار گرفته‌اند و به‌عنوان جايگزين‌هايي براي آنتي‌بادي‌ها در روش‌هاي تشخيصي مختلف از جمله الازا مطرح شده‌اند. هدف از مطالعه حاضر، ارائه روشي براي كونژوگاسيون شيميايي آپتامر به آنزيمhorseradish peroxidase (HRP) با استفاده از لينكر sulfo -succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1- carboxylate (sulfo- SMCC) بود كه توسعه آپتامرها در روش‌هاي تشخيصي را تسهيل كند. استفاده از اين روش براي كونژوگاسيون آپتامر براي نخستين بار انجام شده است.روش كار: مطالعه حاظر در دو قسمت انجام شده است: 1- طراحي و ساخت به روش اكتشافي و 2- بررسي تجربي آن. ابتدا، آنزيم HRP به لينكر sulfo- SMCC متصل و سپس با ستون كروماتوگرافي ژل فيلتراسيون خالص‌سازي شد. در ادامه HRP فعال شده با آپتامر تيوله، مجاور و كونژوگاسيون از طريق واكنش شيميايي مالئيميد- تيول انجام و كونژوگه آپتامر HRP- با استفاده از فيلتر آميكون تخليص شد. براي تأييد كونژوگاسيون آپتامر به HRP، عملكرد كونژوگه حاصل با استفاده از تست الازا مستقيم سنجيده شد و بررسي‌هاي آماري از طريق نرم‌افزار 10Graphpad prism   و تست آماري ANOVA  انجام شد.يافته‌ها: اين تحقيق نشان داد كه ساخت مولكول هيبريدي پروتئين- آپتامر با استفاده از كونژوگاسيون مقدوراست. ساخت مولكول هيبريدي پروتئين در فرايند كونژوگاسيون، آنزيم HRP از طريق گروه آميني خود به انتهاي NHS- ester لينكر sulfo- SMCC متصل و پيوندهاي آميدي پايدار تشكيل شد. آپتامر تيوله با پيوند تيواتري به لينكر متصل شد. در فرآيند ارزيابي كونژوگاسيون از تست الازاي مستقيم با غلظت‌هاي مختلف (۱، ۲ و ۵ ميكرومولار) آپتامر كونژوگه استفاده شد و در هر غلظت، نمونه‌ها به صورت دوپليكيت آزمايش شد. داده‌ها نشان دادند كه غلظت‌هاي مختلف آپتامر كونژوگه تأثير معناداري روي عملكرد آپتامر داشته‌اند. ميانگين جذب نوري در غلظت‌هاي مختلف ۱، ۲ و ۵ ميكرومولار در نمونه‌هاي مثبت به ترتيب 0/5 ، ۱ و 1/6 بود، در حالي كه در نمونه‌هاي منفي ميانگين جذب نوري 0/04 بود كه نشان‌دهنده تفاوت معنادار آماري (0/05  P) بين گروه‌ها و كونژوگاسيون موفق آپتامر بدون تأثير بر عملكرد آن است. نتيجه‌گيري: به نظر مي‌رسد  كه اولا ساخت مولكول هيبريدي پروتئين مقدور است، ثانياً استفاده از آن احتمالاً مفيد خواهد بود و به ‌نظر مي‌رسد كه كونژوگاسيون آپتامر به HRP از طريق لينكر sulfo- SMCC بدون تأثير منفي بر عملكرد آپتامر امكان‌پذير است.