كلون سازي و بيان ژن آنزيم زايلونات دهيدراتاز از كلوباكتر ويبريوئيدس

هدف: زيست توده ليگنوسلولزي مانند ضايعات كشاورزي )ساقه ي ذرت، تفاله چغندر قند و پوست مركبات(، يك منبع به طور گسترده فراوان و بالقوه جذاب براي توليد سوخت هاي زيستي و مواد شيميايي است.قند D- زايلوز دومين قند فراوان در هيدروليز ليگنوسلولزي ميباشد. امروزه تالش هاي قابل توجهي براي گسترش كارخانجات سلولي ميكروبي به منظور به كار گرفتن از D-زايلوز براي توليد مواد شيميايي با ارزش افزوده صورت گرفته است. تركيب آلي D4,2,1- بوتان تري ال )BT( )butanetriol-1,2,4-D )يك ماده شيميايي حد واسط مهم است كه بهطور گسترده در بسياري از زمينه ها مانند داروسازي، كاغذ، مواد پليمري و كاربردهاي نظامي استفاده مي شود. با توجه به اهميت بسيار زياد توليد زيستي BT، يك مسير مصنوعي كه توسط چهار مرحله زايلوز دهيدروژناز، زايلونات دهيدراتاز، -2كتواسيد دكروكسيالز و آلدئيد ردوكتاز كاتاليز ميشود جهت توليد BT از D-زايلوز پيشنهاد شده و به كار گرفته ميشود. از آنجايي كه در اكثر مطالعات انجام شده از ژن زايلونات دهيدراتاز كلوباكتر كرسنتوس استفاده شده است و با توجه به اين كه كلوباكتر كرسنتوس و كلوباكتر ويبريوئيدس شباهت بسيار باالي ژني دارند، هدف از انجام اين مطالعه كلون سازي و بيان ژن زايلونات دهيدراتاز از كلوباكتر ويبريوئيدس در اي. كلي ميباشد. مواد و روش ها: توالي ژني D-زايلونات دهيدراتاز از باكتري كلوباكتر ويبريوئيدس از بانك اطالعاتي NCBI بهدست آمد و بعد از استخراج ژنوم ك. ويبريوئيدس كه از بانك سلولي خريداري شد، با طراحي پرايمرهاي اختصاصي به كمك واكنش زنجيرهاي پليمراز ) Polymerase Reaction Chain ) ، ژن مورد نظر تكثير شد. قطعه ژني در وكتور بياني 28pET كلون گرديد و سپس با استفاده از روش شيميايي به سلولهاي مستعد سويه اي. كلي 3DE (gami-Rosetta )انتقال داده شد. پس از القا سلولها، بيان پروتئين نوتركيب به وسيله ي PAGE-SDS بررسي گرديد. نتايج: با استفاده از آنزيم هاي محدوداالثر و تكثير ژن به كمك واكنش زنجيرهاي پليمراز )PCR Colony )و توالي يابي، فرآيند كلونينگ و ورود قطعه ژني به وكتور بياني 28pET تاييد شد. وجود پروتئين نوتركيب توسط PAGE-SDS با وزن مولكولي حدود 68 كيلودالتون بررسي گرديد و ميزان بيان پروتئين نوتركيب، توسط نرم افزار Image J 54، درصد تخمين زده شد. نتيجه گيري: توليد زيستي بوتان تري ال نيازمند ساخت يك مسير متابوليكي متشكل از چند آنزيم مي باشد. حضور باكتري coli.E به عنوان سويه هدف و استفاده از سوبستراي ارزان قيمتي همچون بايومس حاوي زايلوز و حضور آنزيم زايلونات دهيدراتاز براي توليد BT با سرعت و ميزان باال ضروري ميباشد كه نتايج مطالعات اين پژوهش ميتواند در اين راستا موثر باشد.