جداسازي، همسانه سازي و بيان ژن RNA پليمراز باكتريوفاژ T7 در باكتري E. coli به منظور توليد تجاري

مقدمه: آنزيم RNA پليمراز باكتريوفاژ T7، در رونويسي و بيان پروتئين‌هاي نوتركيب استفاده مي‌شود. اين آنزيم به فاكتور ديگري براي شناسايي پيشبر نياز نداشته، بسيار اختصاصي عمل مي‌كند و فقط ژن‌هاي تحت كنترل پيشبر T7 را بيان مي نمايد. اين ويژگي‌ها موجب شده است كه توليد آنزيم T7 RNA پليمراز در بيوتكنولوژي بسيار پر اهميت باشد.مواد و روشها: در اين تحقيق، براي توليد انبوه و كم هزينه اين آنزيم، سويه باكتريوفاژ T7 به‌عنوان الگو مورد استفاده قرار گرفت. واكنش PCR با استفاده از آغازگر‌هاي اختصاصي كه حاوي سايت برشي براي آنزيم‌هاي BamHI و EcoRI بود انجام گرفت. پس از الكتروفورز محصول PCR، ژن تكثير شدهT7 RNA پليميراز و پلاسميد pGEX2TK توسط اين آنزيم‌ها برش داده شدند و پس از خالص‌سازي، واكنش ليگاسيون بين آن‌ها صورت گرفت. پلاسميد نوتركيب pGEX T7RNAPol با الكتروپوراسيون به باكتري E. coli منتقل شد. گزينش باكتري‌هاي حاوي پلاسميد نوتركيب به كمك PCR انجام گرفت. نتايج: پس از تاييد پلاسميد حاصل، با برش آنزيمي و همچنين با PCR، توالي‌يابي آن انجام و درستي آن مطابق توالي ثبت شده در NCBI تاييد شد. پلاسميد نوتركيب به منظور بيان پروتئين مورد نظر به باكتري E. coli سويه Rosetta منتقل شد. كلني حاوي پلاسميد انتخاب وكشت شد. بيان پروتئين با القاي IPTG در باكتري صورت گرفت و پس از استخراج به كمك SDS PAGE تاييد شد. اين تحقيق پيش‌نياز توليد تجاري و انبوه آنزيم T7 RNA پليمراز مي‌باشد كه پس از بهينه‌سازي بيان و خالص‌سازي پروتئين، توليد تجاري و بومي آن انجام خواهد شد.