تاثير رقيق‌كننده‌هاي لاكتوز، شير پس‌چرخ و تريس بر روي اسپرماتوزوييدهاي منجمد گاوميش

Effect of lactose, skim milk and Tris diluents on frozen buffalo spermatozoa

تركيب رقيق‌كننده مني مورد استفاده قبل از انجماد نقش اساسي را در انجماد موفقيت‌آميز اسپرماتوزوئيدها ايفا مي‌كند. هدف از انجام اين تحقيق شناسايي محلول بافري مناسب براي انجماد مني گاوميش در ايستگاه پرورش و اصلاح نژاد كشورمي‌باشد. براي اين منظور تعداد 16 انزال دو رأس از گاوميش‌هاي نر مورد آزمايش جمع‌آوري گرديد. نمونه‌هاي مني با كيفيت عالي و با داشتن بيش از 70 درصد اسپرماتوزوئيد با تحرك رو به جلو در دماي 37 درجه سانتي‌گراد با سه رقيق كننده مورد نظر تريس، شير پس‌چرخ و لاكتوز رقيق گرديد.نمونه مني رقيق شده پس از طي مرحله خنك كردن (Cooling) در دماي 4 درجه سانتي‌گراد به‌مدت 2 ساعت و نيزاعمال زمان تعادل 6-4 ساعت در دماي 4درجه سانتي‌گراد متعاقب افزودن گليسرول، در پايوت‌هاي 5/0 ميلي ليتري فرانسويبا اعمال زمان انجماد مشخص قبل از ورود در ازت مايع منجمد گرديدند و در داخل كانتينرهاي مخصوص نگه‌داري شدند. پساز گذشت 48 ساعت از زمان انجماد، يخ گشايي (Thawing) نمونه پايوت‌هاي منجمد مورد نظر در دماي 37 درجه سانتي‌گراد به‌مدت 30 ثانيه صورت گرفت. ميزان تحرك و درصد اسپرماتوزوئيدهاي با غشاي پلاسمالماي سالم و يكپارچه و نيز آكروزوم‌هاي دست نخورده نمونه‌هاي مورد آزمايش پس از ذوب به‌ترتيب با استفاده از ميكروسكوپ صفحه گرم با دماي 37 درجه سانتي‌گراد، آزمايش HOST و رنگ‌آميزي گيمسا مورد بررسي قرار گرفتند. نتايج ارزيابي ميزان تحرك اسپرماتوزوئيدهاي نمونه‌هاي مني منجمد تهيه شده بر اساس آزمون آناليز واريانس نشان داد كه درصد تحرك اسپرماتوزوئيدها (ميانگين± انحراف معيار) در محيط رقيق‌كننده تريس (6/3±50) بيشتر از شير پس‌چرخ (5/2±5/44) بوده و در رقيق‌كننده لاكتوز پائين (5/10±4/24) بود (01/0P<). در همين راستا درصد اسپرماتوزوئيدهاي با غشاي پلاسمالماي سالم و يكپارچهو نيز با آكروزوم دست نخورده براي رقيق‌كننده‌هاي تريس، شير پس‌چرخ و نيز لاكتوز مورد نظر به‌ترتيب 2/1±4/41، 8/3±6/32و 4/9±24 ونيز 1/3±0/54، 1/4±4/50 و 2/12±3/27 درصد ثبت گرديد (01/0P<). به‌طور كلي نتايج اين بررسينشان داد كه استفاده از رقيق‌كننده با بافر تريس نسبت به رقيق كننده‌هاي شير پس‌چرخ و يا لاكتوز براي انجماد اسپرماتوزوئيدهاي گاوميش مناسب و قابل توصيه مي‌باشد.

The composition of the extender in which semen is diluted before freezing plays a major role in successful cryopreservation of spermatozoa. This study was carried out to identify the suitable buffer for cryopreservation of buffalo semen. Sixteen split pooled ejaculates from two buffalo bulls possessing more than 70% visual sperm motility, were diluted at 370c either in lactose, skim milk or Tris extenders. The diluted semen was cooled to 40c within 2 hours, equilibrated at 40c for 4-6 hours following the addition of glycerol, filled in 0.5 ml French straws and frozen in a programmable cell freezer before plunging into liquid nitrogen. Semen was thawed at 370c for 30 seconds after 48 hours of storage inside liquid nitrogen. Post thaw visual sperm motility, plasma membrane integrity and acrosome morphology of each semen sample were assessed by warm plate microscopy at 370c, hypo-osmotic swelling test (HOST) and giemsa staining, respectively. Analysis of variance revelated that percentage of post thaw visual sperm motility (Mean± standard deviation) tended to be higher in Tris (50±3.6) than skim milk (44.5±2.5) and lower in lactose (24.4±10.5) extenders (P<0.01). The percentage of spermatozoa with normal plasma membrane and intact acrosome averaged 41.4±1.2 , 32.6±3.8 , 24.0±9.4 and 54.0±3.1 ,50.4±4.1, 27.3±12.2 for Tris, skim milk and lactose diluents, respectively (P<0.01). In conclusion, the result of this study indicated that the use of Tris based buffering system is suitable and recommendable for cryopreservation of buffalo spermatozoa in comparison to skim milk or lactose diluents.