توليد آنتي بادي پلي كلونال عليه ناحيه 4 آنتي‌ژن محافظت‌كننده باسيلوس آنتراسيس در حيوانات آزمايشگاهي

توليد آنتي بادي پلي كلونال عليه ناحيه 4 آنتي‌ژن محافظت‌كننده باسيلوس آنتراسيس در حيوانات آزمايشگاهي

آنتراكس (سياه زخم يا شاربن) يك بيماري مشترك بين انسان و دام بوده و عامل آن باكتري باسيلوس آنتراسيس مي‌باشد. فرم رويشي باسيلوس آنتراسيس داراي يك اگزوتوكسين سه جزيي بوده كه شامل سه آنتي‌ژن حفاظت‌كننده (83 كيلو دالتون)، فاكتور كشنده (90 كيلو دالتون) و فاكتور ادم (89 كيلو دالتون) مي‌باشد. آنتي‌ژن حفاظت‌كننده به‌عنوان يك ايمونوژن اوليه براي توسعه ايمني حفاظتي عليه آنتراكس بررسي شده است. ژن از پلاسميد pXOI با جايگاه‌هاي آنزيمي BamHI و XhoI تكثير و به كلونينگ وكتور و بعد از جداسازي به وكتور pET28a(+) همسانه‌سازي و به باكتري E.coli سويه BL21(DE3) ترانسفورم شد. ناحيه 4ژن آنتي‌ژن محفاظت‌كننده (PA) كلون شده در وكتور بياني pET28a(+) به‌وسيله توالي‌يابي، PCR و آناليز آنزيمي، هم‌چنين پروتيين توليدي به‌وسيله SDS-PAGE مورد تاييد قرار گرفت. بيان ژن PA با القاي IPTG انجام و پروتيين توليد و تخليص شده در 4 نوبت با فاصله 15 روز به موش و خرگوش‌ تزريق شد. سپس آنتي بادي توليد شده از سرم موش و خرگوش جداسازي و توسط تست الايزا و وسترن بلات تاييد گرديد.

Anthrax caused by Bacillus anthracis, is an acute infectious disease that most commonly occurs in herbivorous animals and human. The vegetative state of Bacillus anthracis has a triplex exotoxin, which consists of three polypeptide: protective antigen (PA, 83 kDa), lethal factor (LF, 90 kDa) and edema factor (EF, 89kDa). PA is considered a primary immunogen for the development of protective immunity against anthrax. This study aims to produce polyclonal antibody in laboratory animals. Domain 4 gene was amplified by PCR from pXOI and inserted into expression plasmid pET28a (+) to create the recombinant pET28a (+)/domain4. The pET28a (+)/domain 4 expression vector confirmed by endonuclease digestion, PCR and sequence analysis. The expression of product domain 4 was confirmed by SDS-PAGE. After induced by IPTG, the expression of product domain 4 was analyzed and then was injected to mice and rabbits. All groups received injection four times in 15 days intervals. Finally, the antibody in animals’ sera was confirmed by ELISA and western blotting tests.