تثبيت سلول كامل حاوي آنزيم الكل اكسيداز مخمرPichia pastoris در ژل پلي آكريل آمايد

Immobilization of whole cell Pichia pastoris in polyacrylamide gel beads

الكل اكسيداز اولين آنزيم در مسير اكسيداسيون متانول در مخمر Pichia pastoris مي‌باشد. نقش فيزيولوژيكي آن اكسيداسيون الكل‌هاي با زنجيره كوتاه، تبديل آن‌ها به آلدهيد‌ها است. اما كاربرد اصلي الكل اكسيداز به عنوان آشكارساز در طراحي بيوسنسور الكل‌ها مي‌باشد. در اين مطالعه‌، تثبيت سلول مخمر(‌Pichia pastoris‌) و فعاليت الكل اكسيدازي آن است. در اين پژوهش ابتدا فعاليت آنزيماتيك سلول‌ها با افزودن متانول 5/0 % به محيط كشت القا گرديد‌. سپس نفوذ پذيري ديواره سلولي با cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) افزايش داده شده و در ژل پلي آكريل آمايد تثبيت شدند. فعاليت الكل اكسيدازي در سلول‌هاي تثبيت شده به صورت اسپكتروفوتومتريك با روش ABTS/POD تعيين شد. فعاليت آنزيماتيك سلول نفوذ پذير شده و تثبيت شده در ژل با سلول‌هاي آزاد در شرايط يكسان مقايسه شده و نتايج ثبت گرديد. تثبيت سلول‌ها 14% افزايش را در فعاليت آنزيم نشان داد. فعاليت سلول تثبيت شده حاوي الكل اكسيداز، هنگامي كه 2-بوتانول به عنوان سوبسترا به كار رفت‌، داراي بيشترين مقدار بود. بررسي نتايج اين مطالعه نشان داد كه سلول‌هاي تثبيت شده نسبت به سلول‌هاي آزاد برتري هايي را دارا است كه شامل : افزايش فعاليت آنزيم‌، پايداري‌، جداسازي آسان از محيط كشت براي استفاده مجدد سلول‌ها و تاريخ انقضاي طولاني تر‌، كه موجب كاهش در هزينه توليد مي‌گردد و تثبيت سلول‌ها مي‌تواند به عنوان يك پروتوكل اختصاصي براي بيوسنسور‌هاي الكل‌، توليد آلدهيد‌ها و ساير كاربرد‌هاي صنعتي مورد استفاده قرار گيرد.

Alcohol oxidase is the first enzyme involved in the methanol oxidation pathway of methylotrophic yeasts such as Pichia pastoris, and although itʹs physiological role is the oxidation of short line alcohols to aldehydes. However, the main use of alcohol oxidase has been as biosensors in detection of alcohols. In this study, Pichia pastoris was immobilized and alcohol oxidase activity from this yeast determined. We induced the cells by addition of 0.5% methanol as the carbon source. Following the cells were permeabilized by cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), treated cells were immobilized with entrapment technique in polyacrylamide gel beads. CTAB was found to increase the gel permeability. Alcohol oxidase activity of immobilized cells was determined spectrophotometrically by ABTS/POD method. In similar condition, enzyme activity of permeabled entrapped cells was compared with free cells and the results were indicated. Immobilization cells have been obtained 14 % increase in enzyme activity. This study demonstrated that immobilized cells have been advantageous over free cells, consist of: increasing enzyme activity, stability, easy separate from the reaction media for reuse the cells and longer decay time, which leading to decrease in product cost. Thus, we suggest that cells immobilization can use as an appropriate protocol for alcohol biosensors, aldehyde production and other industrial applications.