شناسايي جدايه هاي *Brenneria nigrifluens

IDENTIFICATION OF Brenneria nigrifluens ISOLATES *

زخم پوستي گردوي ايراني (Juglans regia L.) با عامل Brenneria nigrifluens سبب ايجاد شانكر در پوست تنه و شاخه هاي قطور (مسن) مي شود. تشخيص دقيق و سريع بيماري، عامل مهمي در كنترل و كاهش خسارت بيماري است. در بررسي حاضر 59 جدايه باكتري از 114 نمونه داراي علايم زخم جمع آوري شده از استان هاي مازندران، گلستان، كرمان و كرمانشاه جداسازي شد. به علاوه 10 جدايه از استان فارس، يك جدايه از استان كهگيلويه و بويراحمد و يك جدايه از استان كردستان براي مقايسه با جدايه هاي جمع آوري شده به كار برده شد. جدايه ها براساس ويژگي هاي فيزيولوژيكي و بيوشيميايي به دو گروه B. nigrifluens و گونه‌هاي نزديك به آن تقسيم شدند. بررسي الگوي پروتييني جدايه ها نيز اين تقسيم بندي را تاييد نمود. با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي قطعه دي ان ا (DNA) مورد انتظار به طول حدود 255 جفت باز در 24 جدايه B. nigrifluens تكثير شد كه PCR+ ناميده شدند. پس از گذشت هشت هفته از زمان مايه زني نهال هاي گردو با جدايه هاي PCR+ لكه هاي آبسوخته و زخم پيش رونده اي روي سرشاخه ها ايجاد شد، در حالي كه مايه زني با جدايه هاي PCR¯ نتوانست علايم بيماري را روي سرشاخه هاي مايه‌زني شده ايجاد كند. به منظور تعيين دقيق گونه جدايه ها و بررسي كارايي و فراگيري آغازگرهاي اختصاصي استفاده شده، ناحيه 16S rDNA يك جدايه PCR+ و سه جدايه PCR¯ تكثير و تعيين ترادف شد، نتايج نشان داد كه تنها ترادف 16S rDNA جدايه PCR+ شباهت بالايي با گونهB. nigrifluens داشت. بر پايه نتايج تحقيق حاضر آزمون هاي متداول فنوتيپي به همراه انجام آزمون بيماري زايي و يا آزمون هاي تكميلي مولكولي مانند واكنش زنجيره اي پليمراز با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي براي تشخيص قطعي B. nigrifluens ضروري است.

The shallow bark canker of Persian walnut (Juglans regia L.) trees incited by the bacterium Brenneria nigrifluens affects the bark of trunk and scaffold branches. Fifty-nine isolates of bacterium were isolated on the basis of disease symptoms from 114 plant samples, collected from Mazandaran, Golestan, Kerman and Kermanshah provinces. Furthermore, 10 isolates from Fars province, one isolate from Kohgiluyeh-va-Boyerahmad province and one isolate from Kurdistan province were received. Based on physiological and biochemical characters, bacterial isolates were divided into two groups and identified as Brenneria nigrifluens or strains close to B. nigrifluens. The electrophoretic profile of the strains cell proteins also confirmed this grouping. Isolates were assessed by polymerase chain reaction (PCR) using a specific primer pair for B. nigrifluens. Twenty four isolates produced the expected band of approximately 255 bp and were named PCR+ strains. Pathogenicity tests performed with one PCR+ isolate and three PCR¯ isolates showed that only PCR+ isolate was able to cause cankers in walnut seedlings. Eight weeks after inoculation of PCR+ isolates on Persian walnut seedlings, water-soaked cankers appeared around the inoculation sites. The bacterium was reisolated from the bark lesions of the inoculated seedling on EMB-agar medium. To investigate the certitude of the primer pair, one PCR+ isolate and three PCR¯ isolates from different geographic locations were analyzed by sequencing 16S rDNA. The results revealed that PCR+ isolates were Brenneria nigrifluens. On the basis of this study, it can be concluded that general phenotypic tests are not reliable enough to identify B. nigrifluens isolates and that specific detection of the pathogen with pathogenicity test or PCR is necessary.