تراريختي مينو و دارابي با واسطه آگروباكتريوم و باززايي ريزنمونه‌هاي بيان‌كننده ژن بتاگلوكورونيداز

Agrobacterium–mediated transformation of Minou (Citrus sp.) and Darabi (Citrus grandis) and regeneration of transgenic explants expressing beta–glucoronidase (uid A) gene.

تراريختي دو ژنوتيپ بومي مركبات شامل مينو (Minou, Citrus sp.) و دارابي (Citrus grandis) با واسطه آگروباكتريوم تومه فاشينس، در شرايط مناسبي كه براي بسياري از گونه‌هاي مركبات معرفي شده است، انجام شد. تاثير دو تيمار مختلف شامل مدت زمان هم‌كشتي (24، 72 و 120 ساعت) و غلظتهاي متفاوت هورمون بنزيل آمينوپورين (2، 3 و 4 ميلي‌گرم در ليتر)، كه تاثير زيادي بر روي ميزان تراريختي و باززايي دارند، در يك مجموعه 50 تايي از جداكشتها بررسي گرديد. ناحيه ميان گره شاخه نهالهاي 8–6 ماهه رشد يافته در گلخانه، به طول حدود 1 سانتيمتر بريده شده و به عنوان ريزنمونه براي تراريختي مورد استفاده قرار گرفت. جداكشتها به همراه سويه C58C1 (GV3850) آگروباكتريوم تومه فاشينس واجد پلاسميد pBI121 ، واجد ژن بتا گلوكورونيداز (uid A)، در محيط هم‌كشتي قرار گرفتند. هفتاد و دو ساعت هم‌كشتي در محيط غني از هورمون BAP (5 ميلي‌گرم در ليتر) باعث افزايش تعداد سلولهاي مستعد براي تراريختي در دو انتهاي بريده شده و در نتيجه افزايش ميزان تراريختي و باززايي گرديد. بيان ژن بتا گالاكتورونيداز در ريزنمونه‌هاي تراريخت احتمالي با روش بيوشيميايي و حضور آن با روش PCR بررسي شد. با به كارگيري شرايط بهينه، 8/34 درصد از ريزنمونه‌هاي مينو و 1/30 درصد از ريزنمونه‌هاي دارابي تراريخت شده، ژن گزارشگر بتا–گلوكورونيداز را بيان نمودند. پس از انتقال به محيط نوساقه، ريزنمونه‌هاي تراريخت رشد كرده و شاخه‌هاي 10–5 سانتيمتري قابل پيوند شدن ايجاد كردند. اين اولين گزارش از تراريختي و باززايي ارقام بومي مركبات ايران مي‌باشد.

Agrobacterium–mediated transformation and regeneration of two Iranian citrus genotypes, including Minou (Citrus sp.) and Darabi (Citrus grandis) was carried out in optimized conditions developed for most of citrus species. Additionally the effects of cocultivation period and concentration of Benzyl aminopurin (BAP), notably affecting transgenesis, were also evaluated on a set of 50 explants. Internodal stem segments of 1 cm length from 6–8 month old greenhouse grown seedlings were cocultivated with A. tumefaciens strain C58C1 (GV 3850) caring pBI121 plasmid with introduced beta–glucoronidase (uid A) gene. A 72 hr cocultivation on a medium rich in BAP (5 mg/l) markedly improved transformation frequencies as it increased dividing cells competent for transformation at the cut ends of explants. In these conditions, a transformation efficiency of 34.8 % and 30.1 % was achieved for Minou and Darabi, respectively, as surveyed by GUS expression biochemical assay and confirmed by PCR amplification of uid A gene. The transgenic explants continued to growth in shoot induction medium and produced 5–10 cm shoots competent for grafting. This is the first report of transformation and regeneration of Iranian citrus genotypes.