ساخت گيرنده كايمريك لنفوسيت T داراي كمك محرك OX40 عليه سلول هاي سرطان سينه

Synthesis of chimeric T cell receptor with OX40 co-stimulatory receptor targeted against breast cancer cells

مقدمه و هدف: گيرنده هاي كايمريك سلول هاي T روش خوبي براي ايمنوتراپي سرطان فراهم‌كرده‌است. در اين گيرنده بجاي قطعه متغير گيرنده سلول T از نانوبادي استفاده‌شده‌است. نانوبادي يا VHH كوچكترين قطعه آنتي‌بادي زنجيره سنگين شتري است كه قابليت اتصال به آنتي ژن دارد و نيز همولوژي بسياري با VH انساني داشته، از قدرت ايمني زايي اندكي بهره‌مند است. سازه رسپتور كايمريكي كه در آزمايشگاه ما ساخته‌شده داراي VHH-hing-CD28-CD3? است. اگرچه گيرنده هاي كايمريكي كه از طريق CD3? فعال مي شوند اينترفرون گاما آزاد مي كنند، اما به علت نبود سيگنال هاي كمك تحريكي نمي توانند به طور كامل فعال شوند. لذا وجود CD28 باعث رهاسازي اينترلوكين 2 شده و تكثير تومور را محدود مي كند؛ اما باعث فعال شدن كامل T سل نمي شود. به‌منظور بهبود عملكرد گيرنده هاي كايمريك، اندودامين هاي سه بخشي ساخته‌شده‌است كه شامل CD28-OX40-CD3? است. به دنبال تحريك سلول هاي T كمك محرك OX40 سيگنال هاي قوي فعا‌ل‌سازي و طولاني‌مدت براي اين سلول ها ايجادمي كند كه براي حفظ پاسخ ايمني بسيار مهم است. مواد و روش ها: در اين تحقيق پرايمرهاي هم پوشان كه 60% از توالي OX40 را در برداشت سنتز و قطعه CD28-Ox40-CD3? با روش SOE PCR ايجاد شد و سپس اين توالي با قطعه CD28-CD3? در سازه VHH-hing-CD28-CD3? جايگزين شد. بعد از انتقال اين سازه به درون سلول هاي Jurkat) T) بيان گيرنده در سطح mRNA و عملكرد آن با روش هاي semi-quantitative RT PCR و كيت الايزا سنجش IL-2 ارزيابي‌شد. نتايج و نتيجه گيري: نتايج حاكي از آن است كه عملكرد و بيان سازه داراي OX40 بيشترشده‌است. با توجه به نتايج ارزيابي IL-2 و semi-quantitative RT PCR مي توان چنين نتيجه‌گيري‌كرد كه ميزان بيان سازه‌هاي pCDNA-1 hinge CAR-OX40 و pCDNA-2 hinge CAR-OX40 برابرند اما عملكرد سازه pCDNA-2 hinge CAR-OX40 بيشتر است.

Background and Objective: Chimeric antigen T cell receptors provide a good approach for adoptive immunotherapy of cancer. In this new kind of chimeric T cell receptor, nanobodies are replaced as variable fragment of T cell receptor. Nanobodies (VHH) are the smallest fragments of antibodies that have great homology to human VH and low immunogenic potential. VHH-hing-CD28-CD3و construct was made in our laboratory. Tumor cells rarely provide costimulatory signals and hence CAR receptors that transmit just a CD3و signal can only initiate target cell killing and interferon ? release and fail to induce full activation. Although incorporation of a CD28 component results in IL-2 (Interlukin 2) release and limited proliferation, T cell activation remains incomplete. To optimize CAR signaling, tripartite endodomains were constructed which consist of CD28-OX40-CD3?. During T cell activation, OX40 transmits a potent and prolonged T cell activation signal and it is crucial for maintaining an immunological response. Materials and Methods: We designed overlapping primers that contain 60% of OX40 sequence, then, CD28-Ox40-CD3? region was synthesized by SOE-PCR, consequently, it was replaced with CD28-CD3? region in VHH-Hing-CD28-CD3? construct. Then, this construct was transfected in Jurkat T cells, so IL-2 secretion and T cells proliferation were increased. Results: CD28-OX40-CD3? tripartite cytoplasmic domain provided a full complement of activation, proliferation, and survival signals for enhanced anti-tumor activity. Conclusion: With IL-2 and semi-quantitative RT PCR, it is concluded that mRNA expression of pCDNA-1-hinge-CAR-OX40 and pCDNA-2-hinge-CAR-OX40 constructs are the same but the function of pCDNA-2-hinge-CAR-OX40 construct is more than the others.