جداسازي اسپرم‌هاي منجمد حامل كروموزوم x و ‌ y گاوميش با روش شيب غلظت وارزيابي آن با روش هيبريد كردن در جا با ماده فلورسنت

Separation of X and Y-bearing buffalo frozen spermatozoa using gradient medium and evaluation by fluorescence in-situ hybridization

زمينه مطالعه: تعيين جنسيت اسپرم يكي از راه‌هاي مهم پيش انتخاب جنسي نتاج است كه به همراه تلقيح مصنوعي، توانايي قابل توجهي براي بهبود رونـد اصلاح نـژاد دام‌هـا دارد. هدف‌: ‌هدف از انجام اين تحقيق ارزيابي شيب غلظت ناپيوسته Allgrad درجداسازي اسپرمهاي گاوميش بر اساس كروموزومهاي جنسي به روش هيبريد كردن فلورسنت درجا‌ (FISH)‌ بود. روش كار: جهت جداسازي اسپرم‌هاي حاوي كروموزوم‌هاي جنسي ‌ و ‌ مني منجمد گاوميش پس از ذوب به روش شيب غلظت ستوني از غلظت نامتناوب 4 لايه‌اي از غلظت 65 تا 95 و با اختلاف 10درصد بين لايه‌هاي متوالي با استفاده از محيط ‌ تهيه گرديد. نمونه اسپرم پس از ذوب برروي اولين لايه تيوب قرار گرديد تا اسپرماتوزوييدهاي با چگالي مشابه را پس از سانتريفيوژ در يك سـطـح جمـع آوري واستخـراج نمـايـد. از روش ‌بـا پـروب رنگـي تهيـه شده گاوي براي تمايز اسپرم‌ها در محيط‌هاي تفكيكي استفاده گرديد. شمارش اسپرماتوزوييدها برحسب وجود سيگنال‌هاي رنگي قرمز و سبز كه به ترتيب معرف اسپرم‌هاي حامل كروموزوم‌هاي ‌ و ‌ بود صورت گرفت. نتايج: بر اساس نتايج بدست آمده اختلاف معني‌داري در تعداد اسپرم‌هاي با كروموزوم‌هاي‌‌X درمحيط مايع جداشده از لايه تحتاني نسب به فوقاني (3/78 در مقـابـل 7/21 درصـد)گـزارش گـرديـد(05/0 p < ‌‌.) ازسـوي ديگر در تمامي نمونه‌هاي تحت آزمايش تعداد اسپرماتوزوييدهاي باكروموزوم‌هاي ‌ در مايع جداشده از لايه فوقاني (5/75 در مقابل 5/24 درصد) بيشتر بود ‌(05/0 p < ‌‌.) نتيجه گيري نهايي: به طور كلي نتايج تحقيق حاضرنشان داد استفاده از ستون نامتناوب چهار لايه‌اي محيط Allgrad يك روش مطمين براي جداسازي اسپرماتوزوييدها مني منجمد پس از ذوب گاوميش مي‌باشد.

BACKGROUNDS: Sperm sexing as one of the important ways for pre-selection of offspring along with artificial insemination, has the potential to considerably improve animal breeding and the efficiency of dairy and meat production. The discrepancy between X- and Y- chromosome bearing sperm is the basis of this procedure. OBJECTIVES: The aim of this study was to evaluate a discontinuous sperm isolation medium Allgrad gradient in separation of buffalo spermatozoa according to sex chromosomes by fluorescence in-situ hybridation (FISH). METHODS: A four-layer discontinuous Allgrad gradient, 65%-95% with 10% differences between each subsequent layer were prepared in gradient separation for post thaw X- and Y-bearing spermatozoa. Following centrifugation, sperm from the top and bottom fraction were aspirated and fixed on a slide. The FISH procedure was performed by using X and Y bovine specific DNA probes. At least 400 spermatozoa were scored for each sample. The proportions of X- and Y-bearing spermatozoa were determined by the presence of red or green fluorescent signals. RESULTS: There was no significant difference in the percentage of spermatozoa with the specific signals of X and Y chromosomes in the control groups. After separation, in treatment groups, the percentage of X-bearing spermatozoa in the bottom layer exceeded that of the one in the top layer (78.3 vs. 21.7) (p < 0.05). Adversely, in all treatment groups the significant difference between the frequencies of Y-bearing spermatozoa in the top layers was evident (75.5vs.24.5)(p < 0.05). CONCLUSIONS: This study showed that using four-step discontinuous gradient by Allgrad isolation medium was a reliable method for the separation of X- and Y-bearing frozen-thawed buffalo spermatozoa and can be more expedient for IVF in Buffalo.