بررسي مهار بيان ژن رپرسور گاماگلوبين با روش RNAi در رده سلولي اريتروييدي 562 K با هدف ژن درماني بتاتالاسمي

Evaluation of knocking down of the RNAi mediated gamma globin repressor into K562 cells, for gene therapy of beta-thalassemia

سابقه و هدف: بتاتالاسمي از بيماريهاي ژنتيكي است كه سبب كم‌خوني حاد در افراد مبتلا مي‌شود. يكي از روشهاي درمان بتاتالاسمي، القاي ژن گاماگلوبين جنيني است. كمپلكس پروتييني DRED از رپرسورهاي گاماگلوبين است كه از دو زير واحد متصل شونده به DNA، به نام 2 TRو 4TR تشكيل شده است. يك روش جالب جهت افزايش بيان گاماگلوبين، مهار بيان 4TR توسط مولكول‌هاي siRNA مي‌باشد. هدف از اين تحقيق، راه‌اندازي سيستم RNAi به منظور مهار بيان ژن 4TR سلول‌هاي اريتروييدي 562K و بررسي ميزان بيان گاماگلوبين مي‌باشد. مواد و روشها: از ليپيد2000 lipofectamineTM جهت ترانسفكشن و از پلاسميد گزارشگر pSV-B-Galactosidase جهت بررسي راندمان استفاده شد. بعد از ترانسفكشن siRNA 4TR، ميزان بيان ژن 4TR و گاماگلوبين با روش Real-time PCR در سلول‌هاي 562K تعيين شد. يافته‌ها: نتايج نشان داد با تركيب 2000 LipofectamineTM،40% از سلول‌هاي 562K ترانسفكت شدند. بيان 4TR توسط siRNA 4TR حدود 44% كاهش داشت اگرچه القاي ژن گاماگلوبين 18/1 برابر بود. نتيجه‌گيري: گرچه بيان 4TR تا 44% مهار شد ولي القاي قابل ملاحظه ژن گاماگلوبين مشاهده نشد. براي عدم القاي گاماگلوبين دو مورد قابل بحث است. اول اينكه ميزان ترانسفكشن در سلول‌هاي 562K ، مهار بيان ژن 4TR را محدود مي‌سازد. دوم اينكه شايد مهار 4TR و 2TR بطور همزمان در سلول 562K سبب القاي گاماگلوبين شود. در مجموع با سيستم RNAi در سلول 562K، مهار ژن 4TR رخ داد ولي مهار بيان اين ژن با روش RNAi به تنهايي نمي‌تواند سبب القاي ژن گاماگلوبين شده و در ژن درماني استفاده شود.

Background and Aim: Beta-thalassemia is a genetic disorder manifested by the presence of anemia in adult patients. One approach to treatment of beta-thalassemia is induction of the fetal gamma-globin gene. One of the gamma-globin repressors is a complex called DRED (Direct repeat erythroid-definitive). DRED is composed of TR2 and TR4 DNA binding subunits. The aim of this study was to set up the RNAi system to increase the expression of the gamma-globin gene. Materials and Methods: In this study, lipofectaminTM2000 was used to transfect siRNA molecules and pSV-B-Galactosidase vector was used as a reporter to monitor transfection efficiency. Real-time PCR method was used to measure TR4 knockdown and gamma-globin expression levels. Results: Our findings showed that K562 cells were transfected by 40% using LipofectamineTM 2000. Also, the level of TR4 expression decreased by 44% after using TR4siRNA, even though the expression of gamma-globin gene was induced by 1.18 times. ‍Conclusion: Despite a 44% knockdown of TR4, no increase in gamma-globin mRNA was observed. Two factors may count for this observation; first, TR4 knockdown may have been limited by our transfection efficiency. Second, simultaneous knockdown of TR2 and TR4 may lead to increased gamma-globin levels. In conclusion, although knocking down of TR4 expression occurred by using RNAi system, this can not be a solitary efficient way to induce the gamma-globin expression.