تشخيص آناپلاسما اوويس بر اساس ژن 16S rRNA با روش PCR-RFLP در گوسفندان قسمت مركزي ايران

Detection of Anaplasma ovis based on 16S rRNA gene by PCR-RFLP in sheep from central part of Iran

واكنش زنجيره اي پليمراز يكي از اختصاصي ترين روش هاي تشخيص تفريقي گونه هاي آناپلاسما مي باشد. واكنش زنجيره اي پليمراز بر اساس ژن 16S rRNA مي تواند گونه هاي جنس آناپلاسما را از يكديگر تفريق نمايد ولي توالي نوكليوتيدي ژن 16S rRNA در آناپلاسما اوويس بسيار شبيه به آناپلاسما مارجيناله مي باشد(9/99%تا 2/99%) و طراحي آغازگرهاي اختصاصي براي تكثير اين دو گونه غير ممكن است. گوسفند و بز مي توانند با آناپلاسما اوويس و آناپلاسما مارجيناله آلوده شوند، بنابراين هدف مطالعه حاضر طراحي و بكارگيري آزمون PCR-RFLP در تشخيص اختصاصي گونه هاي مذكور بر اساس ژن 16S rRNA در گوسفند و بز مي باشد. در اين مطالعه 150 نمونه خون و اسمير خوني از گوسفندان بدون علايم بيماري گوسفند داري هاي اطراف اصفهان كه سابقه بيماري هاي منتقله از كنه را داشته اند تهيه شد. در ابتدا گسترش هاي خوني با گيمسا رنگ آميزي شدند و از نمونه هاي خوني كه در گسترش خوني داراي نقاط حاشيه اي در گلبولهاي قرمز بودند DNA استخراج شد. DNAاستخراج شده با آزمون semi-nested PCR اختصاصي براي گونه هاي آناپلاسما اوويس و آناپلاسما مارجيناله وآزمون PCR-RFLP ، با استفاده از آغازگرهاي مشتق از ژن16S rRNA و آنزيم اندونوكلياز (FunD II) MvnI مورد تجزيه و تحليل قرار گرفت. آنزيم اندونوكلياز (FunD II) MvnI توالي (CGCG) را در محصول semi-nested PCR مربوط به آناپلاسما اوويس،ا مورد شناسايي قرار مي دهد و در موقعيت نوكليوتيد 70 محصول مورد نظر را مي برد. در حالي كه اين آنزيم نمي تواند محصول semi-nested PCR مربوط به آناپلاسما مارجيناله(TACG) را برش دهد. آزمون ساده semi-nested PCRو متعاقب آن PCR-RFLP بر اساس ژن 16S rRNA قادر است در كمترين زمان آناپلاسما اوويس را شناسايي و از آناپلاسما مارجيناله تفريق كند و اين روش در تحقيقات اپيدميولوژي و روش هاي كنترلي مفيد و قابل استفاده مي باشد.

One of the most specific methods for the differential diagnosis of Anaplasma spp. is the method of polymerase chain reaction. PCR-based methods on the 16S rRNA gene can differentiate the species in genus Anaplasma but the sequence of 16S rRNA in A. ovis is most similar to that of A. marginale (99.2%-99.9%) and designing of species-specific primers is impossible. Sheep are affected by both A. ovis and A. marginale , so the aim of the present study was to develop and apply species-specific PCRJournal RFLP test based on 16S rRNA gene in sheep and goats. Blood samples and corresponding blood smears of 150 sheep without any signs of diseases were prepared from a region with the previous history of anaplasmosis in Isfahan, Iran. The blood smears were first analyzed by Giemsa staining and DNA extraction was performed only on positive blood samples with Anaplasma spp. in marginal point of erythrocytes in their blood smears. The extracted DNA from blood cells were analyzed by A. ovis and A. marginale specific semi-nested PCR and PCR-RFLP using primers derived from 16S rRNA gene and restriction endonuclease MvnI (FunD II). The restriction endonuclease MvnI (FunD II) recognizes the sequence (CGCG) in corresponding PCR product of A. ovis and cut it in the position 70, whereas the used restriction enzyme leave un-cut the corresponding PCR product of A. marginale (TACG). This simple PCR method based on 16S rRNA gene flowing by RFLP give a rapid discrimination between A. ovis and A. marginale , which is useful for epidemiological survey and development of control strategies.