همسانه سازي پيشبر E8 گياه گوجه فرنگي و بررسي بيان موقت با استفاده از سيستم اگرواينفيلتريشن

Cloning of tomato E8 promoter and its analysis in transient assays using Agro-infilteration system

جداسازي و بررسي خصوصيات پيشبرهاي اختصاصي بافت ميوه، براي دستورزي و بيان هدفمند پروتيين هاي نوتركيب در گياهان از اهميت زيادي برخوردار است. پيشبر E8 يك پيشبر اختصاصي بافت ميوه گياه گوجه فرنگي بوده كه طول كامل آن kb 2/2 مي باشد. در اين پژوهش بخش هسته اي اين پيشبر به طول kb 1/1 مورد استفاده قرار گرفت. با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي و آنزيم pfu پليمراز، قطعه مورد نظر از روي DNA استخراج شده گوجه فرنگي تكثير و همسانه سازي شد. پس از تعيين توالي و تاييد نهايي، پيشبر E8 جايگزين پيشبر دايمي CaMV35S در ناقل دوگانه pBI121 گرديد. پلاسميد نوتركيب با كمك شوك حرارتي به Agrobacterium tumefaciens سويه LBA4404 منتقل شد. با استفاده از روش اگرواينفيلتريشن بيان اختصاصي ژن gus در بافت هاي گياه گوجه فرنگي مورد بررسي قرار گرفت. اگروباكتريوم حاوي ناقل دوگانه pBI121 به عنوان كنترل مورد استفاده قرار گرفت. نتايج حاصل نشان داد كه ژن gus در ميوه هاي گوجه فرنگي به طور اختصاصي بيان مي شود. از اين پيشبر فعال مي توان براي بيان اختصاصي پروتيين هاي نوتركيب در ميوه هاي گياه گوجه فرنگي استفاده نمود.

Isolation and characterization of fruit specific promoters is important for manipulation and targeted expression of recombinant proteins in plants. E8 is a fruit specific promoter with 2.2 kb length. In this study, a 1.1 kb core part of E8 promoter was used. The amplification of the E8 promoter was conducted using specific primers and pfu polymerase by Polymerase Chain Reaction (PCR). After sequencing of E8 promoter for its confirmation, the CaMV35S promoter in pBI121 binary vector replaced by E8 promoter. The recombinant plasmid pBI-E8-GUS was transfered to Agrobacterium tumefaciens LBA4404 by using freeze-thaw method. The specific expression of gus gene in tomato tissue was evaluated using Agro-infiltration method. Agrobacterium harboring pBI121 was used as control. The results showed that gus gene can express specifically in tomato fruits under the control of E8 promoter. Therefore, E8 promoter can be used for tissue specific expression of recombinant protein in the fruit of tomato plants