بهينه سازي بيان، استخراج و تخليص ناحيه N- ترمينال ژن IpaD شيگلا ديسانتري با استفاده از آناليز پروتيوميكسي

Optimization of expression, extraction & purification of the N-terminal region of ipaD gene in Shigella dysenteriae by proteomics analysis

زمينه و هدف: باكتري شيگلا ديسانتري يكي از عوامل پاتوژن مهم است كه علي‌رغم تلاش‌هاي چندين ساله براي تهيه واكسن عليه آن هنوز مطالعات گسترده پيرامون آن ادامه دارد. محصولات پلاسميد تهاجمي شيگلا (Ipa) نقش مهمي در تهاجم باكتري ايفا مي‌كنند. پروتيين IpaD يكي از اعضاي اين خانواده است كه به عنوان كانديد واكسن شيگلا مطرح مي‌باشد. مطالعات متعدد بر روي اين پروتيين نشان داده كه ناحيه N- ترمينال آن نقش مهمي در فرآيند تهاجمي باكتري دارد. اين مطالعه با هدف بهينه سازي بيان N- ترمينال ژن IpaD به منظور افزايش توليد پروتيين نو تركيب انجام شد. روش بررسي: در اين مطالعه تجربي-آزمايشگاهي باكتري E. coli BL21(DE3) حامل پلاسميد pET-28a كه ژن ناحيه N- ترمينال IpaD در آن همسانه سازي شده بود جهت مطالعات مورد استفاده قرار گرفت. پس از كشت باكتري، تاثير سه فاكتور زمان القا، دما و غلظت ماده القا كننده ايزو-پروپيل-تايوبتا دي گالاكتوپيرانوزيد (IPTG) بر ميزان بيان، با استفاده از ژل سديم دو دسيل سولفات-پلي آكريل آميد (SDS-PAGE) به صورت كيفي بررسي گرديد. با استفاده از تصاوير دو بعدي تهيه شده از ژل‌ها با كمك نرم افزار آناليز ژل‌هاي دو بعدي بررسي كمي بيان پروتيين صورت پذيرفت. مراحل استخراج و تخليص پروتيين نوتركيب با كمك روش شيب اوره آغاز و با عبور نمونه‌ها از ستون كروماتوگرافي پايان يافت. يافته‌ها: نتايج بر روي ژل‌هاي SDS-PAGE نشان داد كه ميزان تقريبا مشابهي از توليد پروتيين نوتركيب در زمان‌ القا، دما و غلظت هاي مختلف IPTG بيان وجود دارد، اما يافته هاي نرم افزاري نشان داد بهترين شرايط بيان ناحيه N- ترمينال پروتيين IpaD در وكتور pET-28a دماي 37 درجه سانتي‌گراد، غلظت 7/0 ميلي مولار IPTG و زمان 3 ساعت بعد از القا مي‌باشد. نتيجه‌گيري: بر اساس نتايج اين مطالعـــه هر پروتيين بعد از فرآيند همسانه سازي شرايط بيان مخصوص به خود را دارا مي‌باشد كه شرايط دمايي و طول زمان القا سلول‌ها در مقدار توليد پروتيين موثرتر مي‌باشند.

Background and aims: Shigella dysenteriae is one of the most important pathogens which in spite of many attempts vaccine preparation, extended researches are still in the way, Transport and surface expression of the invasion plasmid antigens (IpaD proteins) have essential role in the pathogenicity of Shigella spp. IpaD has been one of the most important proteins for Shigella vaccine candidate .Studies have shown that N– terminal region of this protein has a key role in the pathogen city and invasion. This study was done to evaluate the optimization of N-terminal region of Ipad in order to increase the production of recombinant protein. Methods: In this experimental labortary study, desired region of IpaD cloned in vector pET-28a (+). For confirming cloning procedure, standard tests were performed. The effect of IPTG concentration, temperature & induction times on the level of protein expression were evaluated by SDS-PAGE, qualitatively. The gels were evaluated with 2-D gel analysis software (Melanie 7). The recombinant protein was extracted by Urea & eventually purificated with affinity chromatography column. Results: SDS-PAGE analysis showed that approximately the same amount of recombinant protein is expressed at different times, but software analysis proved that the optimized condition for the expression of recombinant protein was in the final concentration of 0.7 mM of IPTG, 37?C and 3 hours induction. Conclusion: According to the results every protein has its own expression after the homogenization process, and the temperature and the cells induction time length are more effective in the amount of protein production.