بهينه سازي بيان و تخليص پروتيين نوتركيب ليپوپروتيين مرتبط با پپتيدوگليكان (PAL) باكتري لژيونلا پنوموفيلا

Optimization of gene expression and purification of Legionella pneumophila peptidoglycan associated lipoprotein recombinant protein

زمينه و هدف: اكثر تست هاي موجود براي تشخيص پنوموني لژيونلايي، با مشكلات زيادي از جمله حساسيت و ويژگي پايين و عدم توانايي در فراهم نمودن نتيجه در يك زمان كلينيكي مناسب مواجه هستند. از آنجايي كه ليپوپروتيين مرتبط با پپتيدوگليكان (PAL) لژيونلا پنوموفيلا در درون ادرار ترشح شده و به عنوان يك آنتي ژن در تمام سويه هاي آن وجود دارد. لذا براي تشخيص بيماري لژيونر از طريق ادرار مورد توجه قرار گرفته است. هدف از اين مطالعه بهينه سازي بيان و تخليص پروتيين نوتركيب PAL باكتري لژيونلا پنوموفيلا بوده است. روش بررسي: در اين مطالعه تجربي آزمايشگاهي بيان پروتيين PAL با تغيير در پارامترهاي دانسيته سلولي، مدت زمان القا ، دماي رشد، غلظت ايزوپروپيل بتا دي تيوگالاكتوپيرانوزيد (IPTG) و نوع محيط كشت مورد بررسي قرار گرفت. پس از كلونينگ، عصاره پري پلاسمي تهيه و پروتيين نوتركيب PAL با استفاده از ستون رزين نيكل نيتروتري استيك اسيد (NTA) تخليص گرديد. در نهايت پروتيين نوتركيب PAL با آزمايش وسترن بلاتينگ بررسي شد. يافته ها: با استفاده از محيط كشت Terrific Broth، شروع القا در جذب نوري 6/0 (طول موج 600 نانومتر)، غلظت يك ميلي مولار ماده القا كننده IPTG، دماي رشد 25 درجه سانتيگراد و مدت زمان 15 ساعت پس از القا ، بهترين بيان پروتيين PAL بدست آمد. پروتيين پري پلاسمي نوتركيب PAL با استفاده از ستون رزينNTA با خلوص بيش از 80% تخليص گرديد. نتايج آزمايش وسترن بلاتينگ نيز نشان داد كه پروتيين نوتركيب PAL تخليص شده به طور اختصاصي با آنتي بادي anti-His6-peroxidase شناسايي گرديد. نتيجه گيري: با تخليص پروتيين PAL به ميزان بيش از 80% مي توان به منظور بررسي پتانسيل آن در تشخيص بيماري لژيونر و تهيه كيت تشخيصي بر اساس الايزا از آن استفاده نمود.

Background and aims: There are many problems with most of the available diagnostic tests used to diagnose Legionella pneumonia, including inadequate sensitivity and specificity, and inability to provide a result in a clinically useful time period. Legionella pneumophila PAL protein has been considred as a target for detecting of Legionella infection from urine specimen, because it is conserved sequence and is secreted into the urine. The aim of this study was to optimize expression and purification of L. pneumophila PAL protein. Methods: In this experimental study, optimizing of 5 parameters (cell density, induction time, growth temperature, IPTG concentration and type of medium) was performed. After expression, periplasmic extract was prepared and recombinant PAL protein purified using Ni2+-charged resin column. Finally, recombinant PAL protein was verified by Western blotting. Results: In terrific broth medium, the optimum condition of r-PAL protein induction was occurred at an OD600 of 0.6, 1mM IPTG concentration and 15 hours incubation at 25?C Recombinant periplasmic PAL protein was highly purified ( > 80%) using Ni-NTA column. Western blotting analysis showed that recombinant PAL protein was also specifically recognized by anti-His6-peroxidase antibody. Conclusion: By purification of recombinant PAL protein in purity greater than 80% it can be used to evaluate its capacity in diagnosis of Legionella infection and preparation of diagnostic kit.