بهينه سازي و بيان ژن طراحي شده stxA واجد سه جهش هدفمند (E167Q-A231D-G234E) شيگلا ديسانتري و تخليص آن

Shigella Dysentery Stxa Mutant (E167Q-A231D-G234E) Gene Design and Optimization of Recombinant Protein Expression and Purification

شيگلا ديسانتري با توليد سم stx (با دو زير واحد AوB) يكي از مهم‌ترين‌، باكتري هاي بيماري زا‌ي روده اي براي انسان است. اين سم با ورود به سلول هاي اپيتليال باعث مهار سنتز پروتيين و مرگ سلولي خواهد شد. عليرغم مطالعات فراوان جهت توليد واكسن ، هنوز ضرورت تداوم مطالعه در دست‌يابي به پروتيين نوتر يب از نوع StxA وجود دارد. هدف از اين مطالعه، طراحي ژن stxA جهش يافته و توليد پروتيين بياني آن به عنوان كانديد واكسن عليه شيگاتو كسين جهت بررسي ايمني زايي آن در مطالعات بعدي مي باشد. پس از طراحي و تهيه ژن صناعي pET28a-stxA جهش يافته (G234E- E167Q -A231D) ، واكنش PCR جهت كنترل صحت حضور اين ژن انجام گرديد. پس از انتقال اين وكتور به سلول ميزبان E. coli BL21 ، بيان، بهينه سازي، تخليص و درنهايت تاييد پروتيين حاصل بررسي گرديد. نتيجه مطالعات اوليه، منجر به طراحي ژن stxA جهش يافته گرديد. نتايج واكنش PCR با استفاده از پلاسميد سنتتيك نشان از صحت ژن مورد مطالعه داشت. سپس بيان اين ژن در سلول ميزبان E. coli BL21، بهينه سازي گرديد كه در نتيجه توليد مقادير زيادي از اين پروتيين به شكل اجسام توده‌اي نشان داده شد. تخليص اجسام توده‌اي و سپس محلول سازي پروتيين‌هاي آن از روش‌هاي تلفيقي صورت گرفت. با توجه به مكانيسم اثر شيگاتوكسين پيش بيني مي شود كه اين پروتيين جهش يافته داراي اثر سميت كم‌تري نسبت به ساير جهش يافته هاي قبلي كانديد واكسن داشته باشد، و در نتيجه بتواند به عنوان كانديد واكسن برتر مطرح گردد.

Shigella dysentery producing shigatoxin (subunits A, B) is one of the most important human pathogenic intestinal bacteria. Entering to epithelial cells, the toxin inhibits protein synthesis leading to cell death. In spite of great investigation on vaccine production against S. dysentery studying to achieve significant stxA recombinant protein still remains important. The objective of this study was designing mutant stxA gene and expressing protein production as vaccine candidate against stx for further immunization studies. Three stxA mutant gene including (E167Q-A231D-G234E) were designed and the synthetic gene in pET28a plasmid was obtained and confirmed by PCR. Thereafter the plasmid was transformed into the host cell E. coli BL21 after which gene expression was optimized and protein purity assay was then performed. Preliminary studies led to mutant stop gene design after which it was confirmed by synthetic plasmid and PCR. The expression of this gene in E. coli BL21 host cell was then optimized and resulted in forming large amount of protein inclusion bodies. Purification of inclusion bodies and protein solubilization was performed with a combinatorial method. Regarding the mechanism of shigatoxin effect and simultaneous use of two different mutations in this gene, less toxicity is expected in comparison with previous mutants as vaccine candidate, posing a better vaccine candidate.