اندازه گيري همزمان 25- هيدروكسي كوله كلسيفرول و 25-هيدروكسي ارگوكلسيفرول به روش كروماتوگرافي مايع با كارايي بالا

Simultaneous Determination of 25-Hydroxycholecalciferol and 25-Hydroxyergocalciferol by High-Performance Liquid Chromatography

مقدمه و هدف: با توجه به شيوع بالاي درجات مختلف كمبود ويتامين D در ايران، ارزيابي صحيح وضعيت اين ويتامين براي مقاصد باليني، پژوهشي و بهداشتي اهميت به سزايي دارد. غلظت سرمي 25-هيدروكسي D ) D(OH) (25، به عنوان نماگر معتبر وضعيت ويتامين D پذيرفته شده است. سنجشهاي مبتني بر كروماتوگرافي مايع با كارايي بالا (HPLC)، روشهاي استاندارد اندازه گيري 25(OH)D به شمار مي آيند. هدف از انجام اين مطالعه راه اندازي يك روش معتبر و نسبتاً ساده مبتني بر HPLC براي اندازه گيري غلظت سرمي 25(OH)D با به كار گيري آشكارساز فرابنفش بود. روش كار : پروتيينهاي سرم با استفاده از اتانل و سپس آميزه متانل: ايزوپروپانل (90:10، حجمي) رسوب داده و سپس 25-هيدروكسي كلسيفرول به كمك فاز آلي هگزان، استخراج شد. هگزان تحت گاز ازت تبخير و رسوب حاصله در متانل حل شد و پس از فيلتراسيون،نهايتاً ?L 20 از محلول صاف شده به ستون Teknochroma tracer excel 150?4, 3?m تزريق و كروماتوگرافي با فاز متحرك متانل: آب (85:15، حجمي) حاوي 01/0 درصد BHT و دماي ستون °C 40 انجام شد. اين روش قادر به شناسايي افتراقي D3(OH)25 و D2(OH)25 در طول موج nm 265 بود. نتايج حاصل از آزمايش 90 نمونه سرم انساني با اين روش، با نتايج دو روش رايج پرتو-ايمني سنجي (RIA) و واكنش رقابتي پيوند به پروتيين (CPBA) مقايسه گرديد. درجه همخواني نتايج اين سه روش با استفاده از تعيين ضريب همبستگي و آناليز بلند-آلتمن ارزيابي شد. نتايج: زمان بازداري براي D3(OH)25 و D2(OH)25 به ترتيب 5/9 و 7/10 دقيقه به دست آمد. منحني هاي استاندارد براي D3 (OH) 25 تا غلظت nmol/L 375 و براي D2(OH) 25 تا غلظت nmol/L 5/187 خطي بود. حد آشكار سازي براي هر دو ويتامر L/nmol 5/12 بود. درصد بازيافت براي D3(OH)25 و D2(OH)25 در آزمايش هاي متعدد به ترتيب 6/5 ± 101% و 4/5 ± 8/100% به دست آمد. تغييرات درون و ميان سنجشي براي D3(OH)25 به ترتيب 1/8% و 6/12% بود. دو روش RIA و CPBA نتايج بالاتري نسبت به HPLC به دست دادند (02/0=p). روش RIA در مقايسه با CPBA همخواني بيشتري را با HPLC نشان داد. نتيجه‌نهايي: روش HPLC معرفي شده در اين مطالعه براي اندازه گيري سطوح سرمي 25(OH)D، روشي است قابل اعتماد و نسبتاً سريع با اين مزيت كه توانايي شناسايي افتراقي 25(OH)D2 و 25(OH)D3 را نيز دارد.

Introduction & Objective: High prevalence of vitamin D insufficiency in Iran calls for a reliable assessment of vitamin D status for diagnostic, research as well as public health purposes. Circulating level of 25(OH)D has been generally accepted as a reliable indicator of vitamin D status. HPLC-based analyses are considered as standard methods for 25(OH)D assays. The aim of this study was to set up a precise, reliable and rather simple HPLC-based method to determine serum levels of 25(OH)D using ultra violet detector. Materials & Methods: Serum proteins were precipitated using ethanol and then methanol: iso-propanol (90:10, v/v). 25(OH)D was then extracted using hexane, which was then evaporated under nitrogen flow. The sediment reconstituted in methanol was further filtered. Finally, 20?L of the filtrate was injected to the column, teknochroma tracer excel 150×4, 3 ?m. Chromatography was run with the mobile phase of methanol:water (85:15, v/v) containing 0.01% BHT at the column temperature 40°C. The vitamers 25(OH)D3 and 25(OH)D2 were detected at 265nm. For further evaluation of the method, 90 human serum samples were analyzed for 25(OH)D using HPLC, competitive protein binding assay (CPBA) and radioimmunoassay (RIA). The degree of agreement between those three methods was evaluated using coefficient of correlation and Bland-Altman analysis. Results: Retention times of 25(OH)D3 and 25(OH)D2 were 9.5 and 10.7 min, respectively. Standard curves of both vitamers showed linearity up to 375 nmol/L (D3) and 187.5 nmol/L (D2). Recovery percents for 25(OH)D3 and 25(OH)D2 were found 101±5% and 100.8±5.4%, respectively. Intra- and inter-assay variations for 25(OH)D3 were 8.1% and 12.6%, respectively. The results of RIA and CPBA were significantly higher than those of HPLC (p=0.02). RIA, compared to CPBA, showed more agreement with HPLC. Conclusion: The new HPLC method for serum 25(OH)D determination is reliable and rather fast with the advantage of detecting both 25(OH)D2 and 25(OH)D3.