بيان استرپتوكيناز نوتركيب استرپتوكك گروهA در باكتري اشرشياكلي

Expression of recombinant streptokinase (SKA) of group A streptococci in E. coli

زمينه: استرپتوكيناز A از جمله پروتيين هاي ترشحي استرپتوكك پيوژن است كه قدرت آنتي ژنيك دارد. از اين پروتيين مي توان جهت سيال كردن چرك در ذات الريه و ورم مفصلي چركي و همچنين به عنوان آنتي ژن براي تشخيص عفونت هاي استرپتوككي گروه A استفاده كرد. هدف: مطالعه به منظور توليد استرپتوكيناز استرپتوكك گروه A نوتركيب در باكتري اشرشياكلي انجام شد. مواد و روش ها: در اين تحقيق تجربي با طراحي پرايمر اختصاصي و استفاده از روش PCR، ژن استرپتوكينازA از استرپتوكك پيوژن تكثير و در ناقل پلاسميدي pET32a جهت بيان كلون شد. پلاسميد SKA-pET32a وارد اشريشياكلي سويه BL21-DE3-plySs شد. توليد پروتيين با القا توسط IPTG و بهينه سازي شرايط انجام شد. پروتيين نوتركيب با كيت Ni-NTA خالص و مقدار پروتيين نوتركيب توليد شده با روش برادفورد اندازه گيري شد. آزمايش وسترن بلات براي تاييد پروتيين نوتركيب انجام شد. ترادف نوكليوتيدي ژن تكثير شده با روش سنگر تعيين شد. يافته ها: ترادف ژن تكثير شده كه در پلاسميد pTZ57R/T كلون شده بود با ترادف ثبت شده براي ژن استرپتوكيناز A در بانك ژن، يكسان بود. مقدار پروتيين توليد شده با استفاده از روش برادفورد 3 ميلي گرم بر ميلي ليتر به دست آمد. پروتيين استرپتوكيناز نوتركيب توليد شده با سرم موش واجد آنتي استرپتوكيناز A واكنش داد. پروتيين توليد شده وزني در حدود 67 كيلو دالتون داشت و خاصيت آنتي ژنيك خود را به خوبي حفظ كرد. نتيجه گيري: بيان پروتيين نوتركيب استرپتوكيناز Aدر ميزبان اشرشياكلي نيز امكان پذير است. بنابراين مي توان از آن در تشخيص بيماران مبتلا به عفونت هاي استرپتوككي گروه A به جاي آزمايش هاي آنتي استرپتولايزين O (ASO) و استرپتولايزينO (SLO) استفاده كرد.

Background: Streptokinase A is an antigenic protein secreted by Streptococcus pyogenes. This protein can be used to liquefy pus in pneumonia and the purulent joint swelling and also as an antigen for detection of group A streptococcal infections. Objective: The purpose of this study was expression and production of recombinant streptokinase A of group A streptococci in Escherichia coli in line with diagnostic and therapeutic purposes. Methods: Streptokinase A gene was initially amplified by polymerase chain reaction (PCR) method and sub-cloned into prokaryotic expression vector pET32a. Later, the pET32a vector was transformed into Escherichia coli BL21-DE3-plySs. Gene expression product, induced by IPTG, was purified by Ni-NTA purification kit, and measured by Bradford method. Recombinant SKA was further analyzed by Western Blot. Gene was amplified and sequenced using the Sanger method and the amplified gene in plasmid pTZ57R / T were identical to Recorded sequence in gene bank for streptokinase gene A. Findings: The nucleotide sequence of the gene amplified by PCR was determined by Sanger method. Sequencing results showed similarity in nucleotide sequence of the cloned gene in E. coli with that of group A streptococci available in GeneBank database. The amount of protein product obtained by Bradford method was 3 mg/ml. Recombinant streptokinase protein reacted with mouse sera containing anti-streptokinase A. Conclusion: Our data showed that expression of recombinant SKA protein is possible in Escherichia coli host. The protein product had an approximate molecular weight of 67 kDa with its antigenic properties unchanged. Thus, it can be substituted for ASO and SLO tests used in diagnosis of patients with group A streptococcal infections.