بررسي كارايي تكنيك تكثير دايره‌اي چرخان براي تشخيص سريع قارچ كلادوفيالوفورا كاريوني و كلادوفيالوفورا يگرزي

The Use of Rolling Circle Amplification for Molecular Identification of Cladophialophora carrionii and Cladophialophora yegresii

زمينه و هدف: روند مطالعات اپيدميولوژيك نشان مي‌دهد كه نه تنها بيماري‌هاي قارچي به‌طور قابل چشم‌گيري به‌خصوص در بيماران با نقص سيستم ايمني در حال افزايش است، بلكه كاهش حساسيت عوامل قارچي به داروهاي ضد قارچي نيز در حال افزايش مي‌باشد. بنابراين تشخيص سريع و زود هنگام در حد گونه براي انتخاب داروي مناسب و مديريت باليني ضروري است. با اين وجود روش‌هاي استاندارد تشخيصي وقت‌گير، هزينه بر و از حساسيت كمي برخوردار مي‌باشند لذا براي فايق آمدن بر هر كدام از مشكل‌هاي ذكر شده، ابزارهايي مبتني‌بر PCR توسعه يافته‌اند. در اين مطالعه از روشي كه علي‌رغم سرعت بالا از حساسيت بالايي برخوردار بوده به نام تكنيك تكثير دايره‌اي چرخان براي تشخيص دقيق‌تر و صحيح‌تر دو گونه قارچي كلادوفيالوفورا كاريوني و كلادوفيالوفورا يگرزي استفاده شد. روش بررسي: در‌ اين بررسي به‌طور اختصاصي از ناحيه‌ي رونويسي داخلي (ITS rDNA) از مجموعه‌ي ژني DNA هاي ريبوزومي جنس كلادوفيالوفورا كه قبلا تعيين توالي شده بودند، استفاده گرديد و پروب‌هاي اختصاصي بر اساس تفاوت تنها در يك نوكليوتيد از ناحيه‌ي ITS rDNA براي قارچ‌هاي كلادوفيالوفورا كاريوني و كلادوفيالوفورا يگرزي طراحي گرديد. پروب‌ها در اصل توالي مكمل هدف منتهي به جايگاه لينكر مي‌باشد كه پس از هيبريداسيون با DNA به شكل يك مولكول بسته در آمده، با اتصال به هدف و تكثير در شرايط تك دمايي مورد ارزيابي قرارگرفت. يافته‌ها: نتايج اين تحقيق يك تكثير DNA كاملا موفق را بدون نتايج مثبت و منفي كاذب و تشخيص در حد گونه نشان داد. محصول نتايجRCA در ژل آگارز 5/1 درصد به‌صورت نردباني نشان داده‌شد و واكنش مذكور در جهت تكثير DNAي هدف به طور اختصاصي در اتصال با پروب در كمترين زمان نسبت به روش‌هاي متداول تاييد گرديد. نتيجه‌گيري: نتايج نشان دهنده‌ي قدرت و دقت اين تكنيك در شناسايي عوامل بيماري‌زاي قارچي در حد گونه با سرعت و اختصاصيت بسيار بالا در مقايسه با روش‌هاي شناسايي قديمي مي‌باشد و اين تكنيك مي‌تواند كابرد فراواني در كليه‌ي آزمايشگاه‌هاي تشخيصي داشته باشد بنابراينRCA تفاوت بسيار چشمگيري را با ديگر تكنيك‌هاي وابسته به دما بر پايه‌ي DNA برخوردار مي‌باشد.

Background and Objective: Epidemiological studies indicate that not only the incidence of fungal infections is dramatically on the rise, especially in the immunocompromised hosts, but also the sensitivity of etiological agents to antifungal drugs shows a remarkable reduction. Therefore, early detection at the species level is critically important for proper clinical management. Because standard diagnostic procedures are time consuming, expensive, and less sensitive, PCR-based molecular techniques have been developed. In the present study, we aim to describe a rapid and sensitive technique based on the rolling circle PCR amplification for accurate and fast identification of Cladophialophora carrionii vs. C. yegresii. Materials and Methods: Specific padlock probes were designed based on a single nucleotide polymorphism (SNP) difference in the internal transcribed spacer (ITS) rDNA region of Cladophialophora strains to differentiate between C. carrionii and C. yegresii. The probe sequences are complementary to the target DNA leading to the linker position that after hybridization with the target DNA will be joined together by DNA ligase, form a closed molecule and hybridize to the target DNA for replication at single-temperature conditions. Results: We successfully amplified the target fungi DNA at the species level without any false and negative cross reactivity. The RCA product was visualized on 1.5% agarose gel to clarify the specificity of the probe–DNA template binding. Conclusion: These results demonstrate that RCA is a powerful and accurate tool for discrimination and identification of pathogenic fungi.