مقايسه فعاليت احيايي سه ايزوفرم‌ تيوردوكسين گياه برنج (Oryza sativa) در واكنش با انسولين

Comparison of Reduction Activity of three Rice (Oryza sativa) Thioredoxin Isoforms in Reaction with Insulin

تيوردوكسين‌ها (Trxs) پروتيين‌هايي با وزن مولكولي 14-12 كيلودالتون هستند كه با داشتن يك گروه تيول-دي سولفيد در جايگاه فعالشان (WCG/PPC)، در احيا برگشت‌پذير پيوندهاي دي‌سولفيدي نقش دارند. ايزوفرم‌هاي مختلفي از Trx در گياهان وجود دارند. ايزوفرم‌هاي f، m، x و y در كلروپلاست، ايزوفرم o در ميتوكندري و ايزوفرم h در سيتوزول يافت مي شوند. Trx h داراي اهميت اساسي در رشد و نمو گياه است. در پژوهش حاضر، توالي ژن هاي كد كننده‌ي سه ايزوفرم Trx h از گياه برنج، با نام هاي OsTrx1، OsTrx20 و OsTrx23 جداسازي و همسانه سازي شدند. جهت توليد پروتيين نوتركيب، ژن ها در پلاسميد بياني pET-15b، همسانه سازي و سپس به سويه‌ي مناسبي از باكتري اشريشيا كلي به نام Rosetta (DE3) منتقل شدند. با تحريك پروموتر T7 به وسيله ي IPTG، ميزان مناسبي از پروتيين‌هاي نوتركيب توليد و با استفاده از روش كروماتوگرافي جذبي خالص‌سازي شدند. فعاليت احيايي سه ايزوفرم نوتركيب توليد شده با استفاده از انسولين به عنوان سوبستراي الكترون گيرنده و DTT به عنوان عامل احيا كننده اوليه مورد مقايسه قرار گرفت. هر سه ايزوفرم نوتركيب توليد شده فعال و قادر به احياي انسولين بودند. با اين حال سرعت احياي انسولين در واكنش ها كاملا متفاوت بود كه مي تواند منعكس كننده تفاوت در فعاليت اين ايزوفرم‌ها در گياه و در نتيجه احتمال تفاوت در نقش آن ها نيز باشد.

Thioredoxins (Trxs) are ubiquitous, low-molecular-mass proteins with two cysteins in their active site WC(G/P)PC which are involved in reversible reduction of disulfide bonds. Plants contain several forms of Trxs. Thioredoxin f, m, x and y are found in the chloroplast, Trxo is localized in mitochondria and Trxh is typically cytosolic. Trxh isoforms play important roles in plants development. In this study, we describe isolation and cloning of three cDNAs encoding different Trx h isoforms, stated OsTrx1, OsTrx20 and OsTrx23. Three Trx h were heterologously expressed in Rosetta (DE3) - a strain of Escherichia coli. After inducing T7 promoter with IPTG, proper amount of recombinant proteins were produced. The recombinant proteins were purified by affinity chromatography. The recombinant Trxh isoforms were analyzed for their ability to reduce Insulin – an electron receptor substrate for Trxs- and DTT, as a primary reducing agent. All three isoforms were active, but the rate of reduction varied among different reactions. The existence of observed variations can reveal different functions for thioredoxins in plant system.