شناسايي و تعيين سويه مايكوباكتريوم پاراتوبركلوزيس (MAP) به روش PCR و REA بر اساس قطعات درون جايگير IS900 و IS1311

Identification and strain determination of M. paratuberculosis (MAP) by PCR and REA methods based on IS900 and IS1311 insertion segments

هدف از اين مطالعه شناسايي مايكوباكتريوم آويوم زيرگونه پاراتوبركلوزيس (M. avium paratuberculosis)، بررسي درصد شيوع آلودگي به آن و همچنين بهينه سازي يك روش سريع، دقيق و ساده به كمك PCR براي تشخيص اين زيرگونه و جدايه هاي آن بود. مايكوباكتريوم آويوم زيرگونه پاراتوبركلوزيس (MAP)، از لحاظ اقتصادي عامل يكي از مهمترين بيماري ها در صنعت دامپروري به نام بيماري يون (Johneʹs Disease) مي باشد، كه يكي از عفونت هاي مزمن نشخواركنندگان به شمار مي رود. به منظور شناسايي اين زيرگونه 243 نمونه مدفوع و 56 نمونه شير خام از دام هاي مشكوك گاوداري هاي اطراف مشهد جمع آوري شد. پس از استخراج DNA به منظور شناسايي نمونه هاي آلوده، قطعه درون جايگير اختصاصي MAP به نام IS900 به طول 413 جفت باز، با استفاده از پرايمرهاي P90 و P91 تكثير شد. سپس به منظور تعيين جدايه گاوي و گوسفندي MAP، نسبت به تكثير قطعه درون جايگير IS1311 با طول 268 جفت باز به كمك دو پرايمر M56 و M94 اقدام شد. قطعات حاصله به كمك آنزيم HinfI هضم شدند. تعداد 107 نمونه از 243 نمونه مدفوع (44%) و 10 نمونه از 56 نمونه شير خام (18%) مورد مطالعه، آلوده به MAP بودند. از بين 56 نمونه شير و مدفوع كه از دام هاي يكساني گرفته شده بودند 19 نمونه مدفوع و 10 نمونه شير، آلوده شناسايي شدند (18% در مقابل 34%). نتايج هضم آنزيمي نيز نشان داد كه تمامي MAP هاي شناسايي شده از جدايه گاوي مي باشند.

The purpose of this study was to identifying the M. avium paratuberculosis (MAP), investigating its outbreaks and optimizing a fast, accurate and simple method based on PCR and RFLP for detection of this subspecies and their strains. This pathogen cause a chronic infection called Johneʹs disease. Johneʹs disease a ruminant chronic infection and economically, is one of the most important disease in livestock industry. 243 fecal samples and 56 raw milk samples of suspected cattle, from some farms of Mashhad were gathered. After DNA extraction, in order to identifying contaminated samples, a specific MAP insertion segment called IS900, with length of 413bp was amplified with PCR using P90 and P91 primers. Then, in order to determining the cow and sheep strains of MAP, 268bp fragment of insertion segment IS1311 was amplified with PCR using M56 and M94 primers. The resulting fragments were digested with HinfI restriction enzyme. 107 of 243 stool samples (44%) and 10 of 56 raw milk samples (18%) were identified as infected with MAP. Among 56 Milk and feces samples taken from the same animal, 19 stools and 10 milk samples were identified as infected (18% vs. 34%). Results of enzymatic digestion also showed that all detected MAP were from bovine isolates.