همسانه سازي، بيان و تخليص انتهاي كربوكسيل زيرواحد C آنزيم اوره آز هليكوباكتر پيلوري به منظور توليدIgY در زرده تخم مرغ

Cloning, expression and purification of C-terminal of Helicobacter pylori urease enzyme C subunit for production IgY in chicken egg yolk

سابقه و هدف: هليكوباكتر پيلوري (H.pylori) نوعي باكتري گرم منفي اسپيرال و ميكروآيروفيل است كه در لايه مخاطي معده انسان تكثير و ايجاد عفونت مي نمايد. رويكردهاي جديد در جهت بكارگيري درمان هاي اختصاصي نظير ايمنوتراپي براي ريشه كني اين عفونت مي باشند. آنزيم اوره آز يكي از مهم ترين عوامل بيماري زا و آنتي ژنيك اين باكتري است. روش بررسي: دراين مطالعه تجربي، ابتدا بخش انتهاي كربوكسيل زير واحد C اوره آز، پس از تخليص ژنوم باكتري، با كمك واكنش زنجيره پليمراز (PCR) تكثير شده و محصول روي ناقل بياني pET28a كلون شد. پروتيين نوتركيب پس از تراريخت سازه نوتركيب به باكتري E.coli سوش Bl21DE3 بيان شد و نتايج با استفاده از SDS-PAGE تحليل و پروتيين نوتركيب از طريق كروماتوگرافي ميل تركيبي با كمك ستون Ni-NTA تخليص شد. پروتيين نوتركيب تخليص شده، به مرغ لگ هورن سفيد تزريق و IgY با روش استون/كلروفرم تخليص و با روش ELISA و SDS-PAGE مورد ارزيابي قرار گرفت. يافته ها: با تعيين توالي سازه نوتركيب، صحت انجام همسانه سازي تاييد شد. بررسي با SDS-PAGE نشان داد پروتيين نوتركيب rUreCc به خوبي بيان و تخليص شده است. همچنين نتايج الايزا ايمن زايي بالاي اين پروتيين نوتركيب را نشان داد. نتيجه گيري: توليد پروتيين نوتركيب rUreCc هليكوباكتر پيلوري در E.coli به عنوان سلول ميزبان، امكان دسترسي آسان به آنتي-ژن را فراهم كرد. علي رغم كوچك بودن آنتي ژن نوتركيب، توانايي ايمني زايي آن شبيه به كل زير واحد C اوره آز است

Background: H. pylori is a spiral, microaerophilic gram negative bacterium, that multiplies and causes infection in human gastric mucosal layer. New approaches have focused on using specific treatments, such as immunotherapy, to eradicate this infection. Urease, as one of the most important virulent and antigenic factors of the bacterium, is a suitable target for this purpose. Material and methods: In this experimental study, after purification of bacterial genomic, 3’ segment of ureC gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR). The PCR product was ligated to pET28a. The recombinant protein was expressed followed by transformation of recombinant construct into E. coli BL21DE3. SDS-PAGE analysis was carried out and the recombinant protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography. The purified recombinant protein was injected to hens. IgY recovered from egg yolk, was purified by aceton/chloroform precipitation. The purified IgY was analyzed by ELISA and SDS-PAGE. Results: Sequencing of recombinant construct confirmed accuracy of cloning. SDS-PAGE analysis revealed a good expression and purification of the recombinant protein rUreCc. ELISA observation demonstrated high immunogenicity of the recombinant protein. Conclusion: Production of rUreCc recombinant protein of H. pylori within E.coli, as host cell, provides an easy availability to antigen. In spite of recombinant antigen small size, its immunization potency is similar to total subunit of urease. Also, small size of recombinant protein has an important role in its stability, expression and purification.