توليد لنتيويروسهاي نوتركيب بيان كننده miR-16 توسط ترانسفكشن موقت سلولهاي 293T

• Production of Recombinant Lentiviruses Expressing miR-16 by Transient Transfection of 293T Cells

هدف: هدف از اين مطالعه توليد لنتيويروسهاي بيان كننده miR-16 است. پس از ترانسداكشن، تغييرات ايجاد شده در سطوح بياني اين miRNA و پروتيين هدف آن ارزيابي خواهد شد. مواد و روشها: قطعه ژني حاوي توالي پيشساز miR-16 در پلاسميد لنتي ويروسي كلون شد. سازه نوتركيب همراه با پلاسميدهاي كد كننده پروتيينهاي ساختاري و پوششي ويروس توسط كلسيم-فسفات به رده سلولي 293T ترانسفكت شد. سوپ سلولي جمعآوري و ذرات ويروسي توسط اولتراسانترفيوژ رسوب داده شد و تعيين تيتر ويروس توسط ميكروسكوپ فلورسانت و روش فلوسايتومتري انجام يافت. تغييرات در سطوح بياني miR-16 و پروتيين هدف آن بهترتيب توسط روشهاي Real-time PCR و لكهگذاري وسترن ارزيابي شد. نتايج: تاييد حضور ژن در پلاسميد و درستي توالي آن توسط كلوني-PCR، هضم آنزيمي كلونهاي مثبت و توالييابي انجام شد. پس از ترانسفكشن همزمان سلولهاي 293T با پلاسميد لنتي-miR و پلاسميدهاي ساختاري و پوششي ويروس و تعيين تيتر ذرات ويروسي تغليظ شده، سلولهاي مورد نظر با لنتيويروس نوتركيب آلوده شدند. بيشينه بيان GFP در بيش از 80 درصد سلولهاي آلوده شده با لنتيويروس در MOI=1 حاصل شد. بررسي سطوح بياني miR-16 توسط Real-time PCR نشان داد كه بيان اين ميكرو RNA در سلولهاي آلوده شده با لنتيويروس واجد miR-16 در مقايسه با گروه كنترل افزايش محسوسي دارد. تجزيه و تحليل لكهگذاري وسترن نيز نشان داد بيش بيان miR-16 سبب كاهش بيان پروتيين BCL-2 ميشود. نتيجهگيري: سيستم بياني لنتيويروسي ارايه شده ميتواند بهعنوان ابزاري در راستاي تحويلرساني موثر مقلدهاي ميكرو RNA به سلول پيشنهاد شود.

Objective: The aim of the present study was the production of recombinant lentviruses that express miR-16. After transduction, altered expression levels of miRNA and its target protein were analyzed. Methods: A DNA fragment that contained the miR-16 precursor was cloned in a lentiviral plasmid. Lentiviral vector particles were produced by transient calcium phosphate co-transfection of 293T cells with the combined lenti-miR, structural and packaging plasmids. Viral supernatants were harvested and concentrated by ultracentrifuge. Virus titration was determined by fluorescent microscopy and flow cytometry. Altered expression levels of miR-16 were evaluated by real-time PCR; its protein target was evaluated by Western blot. Results: The identity of DNA was established by colony-PCR, enzymatic digestion of positive clones, and DNA sequencing. After co-transfection of 293T cells with the combined lenti-miR, structural and packaging plasmids, viral particles were concentrated and the virus titer determined. Maximum expression of the GFP reporter gene was obtained in more than 80% of the cells transduced with lentivirus at MOI=1. Real-time PCR assay showed that miR-16 expression levels significantly increased in transduced cells compared with the control group. As shown by Western blot analysis, miR-16 overexpression downregulated Bcl-2 expression at the protein level. Conclusion: This lentivirus expression system could be considered as a tool for efficient delivery of produced miRNAs to cells.