بيان و تعيين خصوصيات آنزيم ارگانوفسفر هيدرولاز باكتريايي در مخمر پيكيا پاستوريس با هدف تجزيه نوروتوكسين‌هاي ارگانوفسفره

Expression and Characterization of Bacterial Organophosphorus Hydrolase in Pichia pastoris with the Intent to Degrade Organophosphate Neurotoxins

هدف: آنزيم ارگانوفسفر هيدرولاز آنزيم هوموديمري است كه قادر به هيدروليز پيوندهاي فسفواستر و كاهش سميت نوروتوكسين‏هاي ارگانوفسفره است. اين خصوصيت آنزيم، ارگانوفسفر هيدرولاز را ابزار ارزشمندي براي تجزيه، تشخيص و زيست‏پالايي سموم ارگانوفسفره مي‌سازد. مواد و روش‌ها: در اين مطالعه ژن آنزيم ارگانوفسفر هيدرولاز باكتري سودوموناس ديمينوتا پس از بهينه‏سازي براي مخمر پيكيا پاستوريس و تبديل آن به فرم ترشحي (آنزيم ارگانوفسفر هيدرولاز به فرم غشايي در باكتري وجود دارد) در ناقل بياني pPICZ?B كلون شد. پس از ترانسفورم و القاي مخمرهاي نوتركيب، آنزيم به لحاظ تجزيه سموم، تعيين پارامترهاي بيوشيميايي و سينتيكي ارزيابي شد. نتايج: آنزيم به ميزان 49/7 مرتبه و با فعاليت ويژه 103 × 421/0 واحد در ميلي‏گرم پروتيين و با بازده 33 درصد از محلول رويي محيط كشت، جداسازي و خالص‌سازي شد. آنزيم بهترين فعاليت و پايداري را تا دماي 50 درجه سانتي‏گراد و pH 7 تا 10 از خود نشان ‌داد. با استفاده از سوبستراي پارااكسون، ثابت ميكاييليس (Km) و حداكثر سرعت آنزيم (Vmax) به‏ترتيب 96/45 ميكرومولار و 23/11 ميكرومولار در دقيقه محاسبه شد. آنزيم نسبت به كاتيون‏هاي دو ظرفيتي بسيار حساس بود و توسط عوامل واسرشته كننده نظير سديم دودسيل سولفات فعاليت خود را از دست ‌داد. وزن مولكولي آنزيم با استفاده از الكتروفورز SDS-PAGE حدود 40 كيلودالتون تخمين زده شد. نتيجه‏گيري: بر اساس نتايج بررسي حاضر آنزيم به‏طور موثري سموم ارگانوفسفره نظير پارااكسون را تجزيه مي‌كند. فعاليت و پايداري در pH و دماهاي بالا و همچنين پايين بودن ثابت ميكاييليس آنزيم نسبت به انواع باكتريايي، آن را كاتاليزگر زيستي مناسبي براي كاربردهاي زيست‏پالايي و تشخيصي مي‌سازد.

Objective: Organophosphorus hydrolase (OPH) is a homodimeric enzyme that can hydrolyze phosphoester bonds and reduce the toxicity of organophosphorus compounds. This makes OPH a suitable element for the biodegradation of these compounds. Methods: We successfully cloned the OPH gene from Pseudomonas diminuta, after optimization for Pichia pastoris, into a yeast expression vector (pPICZ?B). After transformation and induction of recombinant yeasts, the expressed enzyme was investigated for its biochemical and kinetical parameters. Results: The enzyme was purified 7.49-fold to a specific activity of 0.421×103 U/mg protein from the supernatant with a yield of 33%. The purified enzyme was able to degrade organophosphates. It had an optimal activity and stability up to 50°C, and a pH range of 7.0-10.0. The enzyme had a Km of 45.96 µM and a Vmax of 11.23 µM/min (421 µM/min/mg) for paraoxon as a substrate. This enzyme was sensitive to divalent cations and inactivated by denaturing compounds such as SDS. The molecular mass of the purified enzyme as estimated by SDS–PAGE analysis was approximately 40 kDa. Conclusion: In this study, the purified enzyme effectively hydrolyzed paraoxon, an organophosphorus compound. The activity and stability of this enzyme at high temperatures and pH, and low Km in comparision with bacterial isolates could make it an attractive biocatalyst for applied bioremediation and biosensing.