كلون، بيان و تخليص مايكوليل ترانسفراز C مايكوباكتريوم توبركلوزيس در ميزبان پروكاريوتي

Cloning, Expression and Purification of Mycolyltransferase C of Mycobacterium tuberculosis in the Prokaryotic Host

هدف: كمپلكس آنتي‏ژن 85 مايكوباكتريوم توبركلوزيس شامل سه پروتيين ترشحي است كه خاصيت ايمني‏زايي دارند. اين پروتيين‏ها كانديداهاي مهمي در طراحي واكسن سل هستند. براي استفاده از اين پروتيين‏ها به‏عنوان واكسن‏هاي زيرواحدي يا به‏عنوان يادآور براي BCG نوتركيب يا واكسن‏هاي DNA، توليد آنتي‏ژن‏هاي پروتييني به شكل نوتركيب الزامي است. پروتيين‏هاي مايكوباكتريوم كه در ديواره هستند نسبتاً غيرقطبي است و توليد آن‏ها به شكل نوتركيب در سويه بياني اشريشيا كلي با پروتيين‏هاي ديگر متفاوت است. هدف از اين مطالعه توليد و تخليص آنتي‏ژن نوتركيب 85C به‏عنوان يك ايمنوژن است. مواد و روش‏ها: آنتي‏ژن 85C در حامل پلاسميدي pJET1.2 و در نهايت در pET32a(+) كلون و در هر دو پلاسميد تعيين توالي شد. القاي توليد پروتيين با IPTG صورت گرفت و تخليص با حل كردن اجسام توده‏اي داخل سلولي در اوره، جذب با رزين نيكل، حذف اوره با شيب كاهشي اوره در محلول‏هاي شستشو و در نهايت جمع‏آوري پروتيين نوتركيب به شكل محلول انجام شد. تاييد آنتي‏ژنيك پروتيين نوتركيب با وسترن بلات و توسط آنتي‏بادي ضد پلي‏هيستيدين، آنتي سرم پلي‏كلونال خرگوشي ضد مايكوباكتريوم توبركولوزيس و سرم بيمار سلي بستري انجام شد. نتايج: ژن آنتي‏ژن 85C با موفقيت كلون و با تعيين توالي تاييد شد. آنتي‏ژن 85C در ميزبان اشريشيا كلي بيان و تخليص شد. نتيجه‏گيري: نتايج وسترن بلات به موازات نتايج تعيين توالي نشان دهنده درستي توليد پروتيين آنتي‏ژن 85C نوتركيب و حفظ نسبي ساختار اپي‏توپي آن است.

Objective: Antigen 85 complex of Mycobacterium tuberculosis includes three immunogenic proteins which are important TB vaccine candidates. The use of these protein as a component of subunit vaccines, as a part of DNA vaccines or recombinant BCG boosters, enhances their recombinant production. Recombinant production of these mycobacterial proteins located in the cell wall somehow differs from the other proteins, as they are partially apolar. Therefore, this study aims to produce recombinant Ag85C as a vaccine candidate. Methods: Ag85C gene was cloned in pJET1.2 and subsequently in pET32a(+). Both recombinant plasmids were sequenced. Expression of the recombinant protein was induced with 1mM IPTG. Recombinant Ag85C was purified through dissolving the inclusions in 8M urea buffer, absorbed to Ni-NTA resins, washed by buffers with decreasing urea concentrations, and finally eluted in aqueous solution. Western blot analysis was performed using anti-6His tag antibody, rabbit anti-M. tuberculosis polyclonal antibody, and the serum from hospitalized TB patients. Results: Ag85C successfully cloned in both plasmid vectors. The recombinant Ag85C expressed in the E. coli host and was purified with significant yield. Conclusion: Western blot results along with that of sequencing ensure accurate production of recombinant Ag85C, retaining its partial epitopes.