ساخت بكميدهاي نوتركيب واجد ژن هماگلوتينين ويروس آنفلوانزاي انساني

Construction of Recombinant Bacmid DNA Encoding Influenza Virus A (H1N1) Hemagglutinin Gene

هدف: ويروس آنفلوانزاي A (H1N1) از مهم‏ترين زيرگونه‏هاي ويروس آنفولانزاست كه منجر به پيامدهاي متعددي در جهان شده است. هماگلوتينين يكي از مهم‏ترين آنتي‏ژن‏هاي اين ويروس مي‏باشد كه باعث ايجاد پاسخ ايمني مي‏شود. اتصال اين پروتيين به گيرنده‏هاي سلول ميزبان منجر به شروع فرايند بيماري‏زايي مي‏شود. با توجه به نقش حياتي مرحله اتصال ويروسي، اين پژوهش درصدد استخراج و جاي‏سازي ژن هماگلوتينين و زيرواحد بزرگ آن (HA1) با هدف توليد شاتل ناقل نوتركيب باكيولوويروس (بكميد) براي توليد پروتيين نوتركيب در سلول‏هاي حشره است. مواد و روش‏ها: ويروس آنفلوانزاي انساني A/New Caledonia 99/20/(H1N1) در كشت سلولي MDCK تكثير شده و RNA كامل ويروسي توسط محلول Easy–red تخليص شد. سپس طول كامل ژن هماگلوتينين و ژن HA1 توسط روش RT-PCR و آغازگرهاي اختصاصي تكثير و ابتدا در ناقل pGEM-TEasy و سپس در پلاسميد pFastBac HT جاي‏سازي شد. در نهايت بكميد نوتركيب واجد ژن‏هاي فوق در سلول‏هاي ميزبان DH10Bac توليد شد. نتايج: محصولات PCR ژن هماگلوتينين با الكتروفورز روي ژل آگارز و هضم با آنزيم‏هاي محدودالاثر ارزيابي شد. ناقل نوتركيب pGEM-Teasy و پلاسميد دهنده نوتركيب pFastBac HT توسط روش PCR، هضم آنزيمي و تعيين ترادف تاييد شد. توليد DNA نوتركيب بكميدي نيز توسط افتراق كلوني‏هاي آبي-سفيد، الكتروفورز روي ژل آگارز 7/0 درصد، PCR با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي و آغازگرهاي pUC/M13 مورد تاييد قرار گرفت. نتيجه‏گيري: در اين پژوهش، بكميد نوتركيب واجد ژن هماگلوتينين و زيرواحد بزرگ آن با موفقيت ساخته شد. در ادامه سلول‏هاي حشرات به‏منظور توليد باكيولوويروس نوتركيب با سازه‏هاي فوق ترانسفكت شده و پروتيين‏هاي نوتركيب براي مطالعات آتي توليد خواهد شد.

Objective: Influenza virus A (H1N1) is an important subtype of the influenza respiratory viruses, which has important worldwide implications. Hemagglutinin (HA), an important viral antigen, is responsible for binding to human cell receptors leading to an onset of the disease process. Considering the critical role of viral attachment, this study focuses on the extraction and cloning of HA and its large subunit HA1 genes to generate recombinant baculovirus shuttle vectors (bacmid) in order to produce recombinant proteins in insect cells. Methods: Human influenza virus A/New Caledonia 99/20/(H1N1) was propagated in MDCK cell culture. Total viral RNA was extracted using easy-red solution. The full-length HA genome and HA1 fragment were amplified by RT- PCR using specific primers, cloned into a pGEM®-TEasy vector, and then subcloned into a pFastBac HT plasmid. Finally, recombinant bacmids that contained the genes of interest were produced in E. coli DH10Bac™ cells. Results: Expected PCR products of HA genes were evaluated through gel electrophoresis and restriction enzyme analysis. Recombinant pGEM®-TEasy vectors and pFastBac HT donor plasmids were confirmed by PCR, digestion, and sequencing. Construction of recombinant bacmid DNA was verified by using blue-white colony screening, overnight electrophoresis, and PCR analysis that used either pUC/M13 or gene-specific primers. Conclusion: In this study, we have successfully constructed recombinant Bacmid DNA that encoded the full-length HA genome and its HA1 subunit. We intend to transfect sf9 insect cells with these constructs to generate recombinant baculovirus and produce large amounts of desired proteins for future studies