ساخت وكتور minicircle حاوي ژن مقاومت به پورومايسين

Construction of a Minicircle DNA Vector Carrying Puromycin Resistance Gene

وجود توالي‌هاي باكتريايي در پلاسميد‌هاي معمول علاوه بر ايجاد مشكلات ايمني سبب كاهش بيان ژن مي گردد. وكتورهاي minicircle وكتورهايي خارج كروموزومي وفاقد توالي‌هاي باكتريايي مي‌باشند. اين وكتور ها به واسطه يك نوتركيبي درون مولكولي توسط يك ريكامبيناز از پلاسميد والدي ساخته مي شوند. در اين مطالعه يك حامل minicircle حاوي ژن مقاومت به پورومايسين ساخته شد. به اين منظور ابتدا يك پلاسميد والدي ساخته شد كه حاوي ژن اينتگراز?C31 قابل كنترل با پروموتر قابل القاي araBAD ، توالي‌هاي attP وattB اختصاصي ژن اينتگراز?C31 در دو طرف ژن Puro و توالي‌هاي لازم براي بيان آن ، يك شاخص انتخابي براي غربالگري در باكتري‌ها وتوالي شروع براي همانندسازي در باكتري مي‌باشد. با القاي بيان اينتگرازتوسط آرابينوز، فرآيند نوتركيبي توسط اينتگراز صورت گرفت و minicircle حاوي ژن Puro در باكتريE.coli ساخته شد. با توجه به بيان بالا وعدم الحاق وكتور‌ها ي minicircle در ژنوم، وكتورminicircle توليد شده در اين مطالعه ابزار مناسبي براي غربالگري سلول‌ها به منظور ايجاد رده‌هاي سلولي پايدار مي‌باشد.

The presence of bacterial backbone in conventional plasmids reduces gene expression and immunity problems in host organisms. Minicircle vectors are episomal and void of bacterial sequences. These vectors are made through intra-molecular recombination by recombinase from parental plasmids. In this study, a minicircle vector carrying puromycin resistance gene was constructed. For this reason, a parental plasmid was constructed including integrase ?C31 encoding gene under control of araBAD inducible promoter, specific recognition sites of integrase?C31 in both sides of puromycin resistance gene and necessary sequences for its expression, a selectable marker for screening in bacteria and origin of replication. After integrase expression induced by arabinose, the process of recombination was carried out by integrase, and a minicircle vector containing the Puro gene was constructed in the bacterium E.coli. Because of the high expression and lack of integration of the minicircle vectors in genome, these vectors are suitable for cell screening in order to generate stable cell lines.