كلونينگ و بيانژن( (stxBشيگلا ديسانتري تيپ 1 در باكتريRoestta DE3E. coli

Cloning and Expression of stxB Gene from Shigella dysenteriae Type 1 in E.coli Rosseta DE3.

شيگلوزيس يك مسيله جهاني مهم براي سلامتي بشر محسوب مي شود. تا به امروز واكسن موثري عليه شيگلا يافت نشده است. يكي از مهمترين فاكتورهاي بيماري‌زاي اصلي در شيگلا ديسانتري تيپ 1، انتروتوكسين شيگلا يا ST مي‌باشد كه توسط ژن stx كد مي شود. شيگا توكسين يك پروتيين شش زير واحدي با وزن مولكولي 5/70 كيلو دالتون بوده كه از يك زير واحد به نام STxA و يك زير واحد پنتامريك غير سمي متصل شونده به رسپتور به نام زير واحد B يا STxB تشكيل شده است. زير واحد اخير باعث اتصال و ورود سم به درون سلول و اثرات آن مي‌شود.STxB يك آنتي ژن كانديد واكسن براي شيگلوزيس محسوب مي شود. در اين مطالعه با استفاده از توالي ژن stxB بدست آمده از بانك ژني NCBI طراحي پرايمر صورت گرفت. ژن مورد نظر با استفاده از روش PCR از باكتري شيگلا ديسانتري تيپ 1 تكثير يافت و در پلاسميد pGEM- T Easy vetorكلون و سپس در وكتور بياني pET-28a(+) ساب كلون شد. ژن stxBدر باكتري E. coliسويه Rosetta DE3 بيان گرديد. پروتيين توليدي توسط ستون نيكل تخليص و از لحاظ وزن مولكولي و ايمنوبلاتينگ توسط ژل SDS-PAGE و وسترن بلات مورد تاييد قرار گرفت.هدف از انجام اين مطالعه توليد پروتيين STxB به منظور استفاده آن در بررسي ايمني زايي و توليد آنتي بادي پلي كلونال عليه سم شيگلا ( شيگا توكسين ) بود .

Shigellosis is a global human health problem. Currently, no vaccines against Shigella infection exist. Shiga toxin(ST) is a main virulence factor in Shigelladysenteriae type I that encoding by stx gene. This toxin is a hexameric protein with a molecular mass of 70.5 kDa, which is composed of anStxA monomer and a receptor-binding StxBhomopentamer subunit. Shiga toxin A subunit (stxA),mediates toxicity and B subunit (stxB) is a nontoxic proteinresponsible for toxin binding and internalization into target cells.stxB is a candidate vaccine antigen for Shigellosis .In this work, primer designing done by using of stxB gene sequence that gets from NCBI.The stxB gene was amplified by PCR than cloned in pGEM- T Easy vetorand was subcloned in pET-28a(+)as anexpression vector. stxB genewas expressed in Escherichiacoli Rosetta DE3, and purified by a Ni-NTA resin column, then detected molecular weight and immunogenicity by SDS-PAGE and Western-blot.goal of this work was production of STxB protein . Purified protein was used in our next studies such as an immunization and production of polyclonal antibody against shiga toxin.