همسانه سازي و بررسي بيان موقت پيشبر pat1 گياه سيب زميني با استفاده از سيستم اگرواينفيلتريشن

Cloning of the potato Pat1 promoter and survey the transient expression using Agro-infiltration system

پيشبرها يكي از عناصر كليدي مهندسي ژنتيك براي هدفمندي بيان ژن ها محسوب مي شوند. به منظور بيان اختصاصي ژن در غده هاي سيب زميني عمومي ترين پيشبر مورد استفاده پيشبرPatatin است. پاتاتين گروهي از گليكوپروتيين ها هستند كه به وسيله يك خانواده چندژني رمزسازي مي شوند. اين پروتيين ها بيش از 40% پروتيين هاي محلول در غده سيب زميني را به خود اختصاص مي دهند. پيشبرهاي كلاس I به طور عمده مسيول بيان پاتاتين هاي غده بوده و بنابراين الگوي بيان اختصاصي براي غده داشته و در بخش بافت پارانشيمي آن به مقدار زياد وجود دارند. هدف از اين تحقيق همسانه سازي پيشبر اختصاصي غده سيب زميني (پاتاتين كلاس I (pat1)) و بررسي بيان اختصاصي آن مي باشد. پس از استخراج DNA ژنومي از گياه سيب زميني، پيشبر Pat1 با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي همسانه سازي شد. قطعه مورد نظر با دو آنزيم برشي BamHI و HindIII جدا و خالص سازي شده وجايگزين پيشبر دايمي CaMV35S در ناقل دوگانه pBI121 گرديد. پلاسميد نوتركيب به روش شوك حرارتي به Agrobacterium tumefaciens سويه LBA4404 منتقل گرديد. با استفاده از روش اگرواينفيلتريشن بيان اختصاصي ژن gus در بافت هاي گياه سيب زميني مورد بررسي قرار گرفت. نتايج حاصل نشان داد كه در مقايسه با پيشبر CaMV35S ، پيشبر PatI نيز با كارايي بالايي باعث بيان ژن gus در غده ها مي شود.

To achieve the high level of gene expression, promoters are key elements. Patatin promoter has been used as a specific gene expression in potato tubers. Patatin is a group of glycol protein in potato tuber which is code by a multiple family genes. This protein makes up more than 40% of soluble proteins of potato tubers. Class I Promoters mainly responsible for tuber-specific expression pattern of proteins and located high amount in tuber parenchyma tissues. The purpose of the present study is the cloning and expression assay of tuber specific promoter, patatin class I (pat1). Total DNA of the potato tissue samples was extracted and the pat1 promoter was amplified using specific primers and pfu polymerase by polymerase chain reaction (PCR). The fragment was isolated by two restriction enzymes (BamHI, HindIII) and was replaced with CaMV35S promoter in pBI121 vector. The recombinant plasmid was transferred to Agrobacterium tumefaciens LBA4404 strain using freez-thaw method. The specific expression of gus gene in potato tissue was evaluated using agro-infiltration method. The results of the this experiment confirmed the specific expression of the gene.