بيان ژن NS1 ويروس H9N2آنفلوآنزاي پرندگان

Expression of NS1 gene of avian influenza H9N2 virus

ويروس آنفلوانزاي پرندگان از جنس آنفلوانزا ويروس A و از خانواده ارتوميكسوويريده مي باشد. هدف از اين تحقيق كلون كردن و بيان ژن كد كننده‌ پروتيين NS1 از يك جدايه‌ ويروس آنفلوانزاي پرندگان تحت تيپ H9N2بود كه از يك گله جوجه گوشتي در اهواز كه داراي علايم تنفسي و تلفات بود به دست آمد. پروتيين NS1 جهت طراحي تست اليزا، براي تفريق طيور عفوني از طيور واكسينه شده، استفاده مي-شود. بدين منظور ابتدا براساس چندين توالي نوكليوتيدي ناحيه كد كننده ژن NS1 (از نوكليوتيد 27 تا 680)، از ويروس آنفلوانزاي پرندگان H9N2 كه از منابع اطلاعاتي استخراج شدند، پرايمرهاي لازم طراحي شدند. سپس ژن NS1 با استفاده از روش RT – PCR تكثير داده شد. وكتور pMAL-c2X و ژن تكثير يافته NS1 هر دو توسط آنزيم‌هاي محدود كننده EcoRI و PstI هضم و سپس با استفاده از آنزيم ليگاز DNA T4 به همديگر پيوند داده شدند. در مرحله بعد اين ساختار به سويه BL باكتري E.coli منتقل شد و در پايان وكتور نوتركيب تخليص شده جهت بيان پروتيين NS1 مورد استفاده قرار گرفت. پروتيين هدف با وزن حدود 4/ 66 كيلو دالتون از طريق SDS-PAGE و متعاقب آن وسترن بلات مورد ارزيابي قرار گرفت. مشاهده بيان پروتيين با وزن ملكولي قابل انتظار در SDS-PAGE و واكنش مثبت اين پروتيين با سرم پرنده آلوده به آنفلوانزا در وسترن بلات نشان دهنده بيان موفق ژن غير ساختاري (NS1) در E.coli بود.

Avian Influenza Virus (AIV) is classified in the genus of influenza virus A within the Orthomyxoviridae family. The aim of this study was the cloning and expression of NS1 gene belongs to an avian influenza virus isolate (A/Chicken/Iran/AH-1/06), serotype H9N2 from a broiler chicken flock in Ahvaz, with respiratory signs and mortality. The NS1 protein is used for the DIVA test (Differentiating Infected from Vaccinated Animals) in the form of an ELISA test. For this purpose several nucleotide sequence of the NS1 coding region (from nucleotide 27 to 680) of avian influenza virus subtype H9N2 retrieved extracted from the Gene bank in order to design the required primers. The NS1 gene was subsequently amplified by RT – PCR . The vector, pMAL-c2X and the amplified NS1 gene, both were digested by EcoRI and PstI restriction endonucleases and ligated by T4 DNA ligase. The construct was then transformed into BL strain of E.coli and finally the purified recombinant vector was used for expression of NS1 protein. The 66.4 KDa protein was identified by both SDS-PAGE and Western blotting. Observation of expressed protein with the expected molecular weight in SDS-PAGE and a positive reaction with avian influenza virus H9N2 infected chicks sera by Western blotting revealed a successful expression of the segment of NS1 gene in E.coli.