رديابي Polymyxa betae در ريشه چغندر قند با استفاده از روش هاي ميكروسكوپي، سرولوژيكي و مولكولي

Detection of Polymyxa betae in sugar beet roots using microscopical, serological and molecular methods

به منظور طراحي يك سيستم تشخيصي و سنجش دقيق P. betae در چغندرقند سه روش ميكروسكوپي، سرولوژيكي و مولكولي روي يك رقم حساس به عامل و ناقل بيماري ريزومانياي چغندرقند با يكديگر مقايسه شدند. ابتدا رقم حساس رجينا در مخلوط مساوي از خاك آلوده و كمپوست در گلخانه كشت شد. پنج هفته پس از كاشت، ريشه گياهان در محلول اسيد فوشين- لاكتوفنل رنگ آميزي شد. آزمون الايزا با استفاده از آنتي بادي اختصاصي عليه پروتيين نوتركيب گلوتاتيون- اس- ترانسفراز P. betae بهينه سازي شد. براي اين كار عصاره ريشه بوته هاي سالم و آلوده تهيه و در آزمون DAS- ELISA استفاده شد. حضور P. betae در ريشه گياهان با استفاده از تكثير هم زمان منطقه اختصاصي rDNA پلاسموديوفوروميست ها و آغازگر اختصاصي آن رديابي شد. وجود سيستوسورهاي P. betae در ريشك هاي بوته هايي كه در خاك آلوده بودند مشاهده شد. نتايج آزمون الايزا بوته هاي سالم و آلوده را از يكديگر تفكيك نمود. ميانگين جذب نوري در طول موج 405 نانومتر در بوته هاي سالم 126/0، بوته هاي آلوده 75/0، پروتيين BSA (كنترل منفي) و GST(كنترل مثبت) به ترتيب 11/ 0 و 45/2 بود. واكنش PCR دو قطعه 454 و 170 جفت باز را در نمونه هاي آلوده مربوط به منطقه rDNA و نشانگر اختصاصي از P. betae را تكثير كرد. به اين ترتيب به نظر مي رسد براي رديابي سريع P. betae در چغندرقند و ساير ميزبان هاي آن مي توان از روش مبتني بر PCR و براي ارزيابي مقاومت ژرم پلاسم چغندرقند از آزمون الايزا بهره برد.

In order to design a precise diagnostic and quantitative system to detect of P. betae in sugar beet roots, three procedures including microscopical, serological and molecular methods were compared on a sugar beet cultivar susceptible to causal agent and vector of rhizomania disease. At first, susceptible cultivar Regina was cultivated in infested soil in greenhouse condition. After 5 weeks, roots of plants were stained with fuchsin- acid- lactophenol solution. Quantitative ELISA test was optimized with specific antiserum against recombinant protein glutathione s- transferase (GST) of P. betae. Running ELISA test, extracts of health and infected plants were prepared and used in DAS- ELISA test. Presence of P. betae in roots of plants was detected with amplification of rDNA of Plasmodiophoromycetes and P. betae species, simultaneously. Existence of cystosori of P. betae was observed in all of the plants planting in infested soil. Results of ELISA test were distinguished healthy plants from infected plants. Average of optical density at 405 nanometer for healthy plants, infected plants, protein PBS (negative control) and GST (positive control) was 0.126, 0.75, 0.11 and 2.45 respectively. Duplex PCR method was amplified two fragments of 454bp and 170bp in infected samples relating to rDNA region and specific region of the P. betae, respectively. Based on the results, it seems that, rapid detection and identification of P. betae in sugar beet and other hosts of the vector could be done on the basis of PCR method. Evaluating of resistance germplasm of sugar beet to P. betae could be recognized using quantitative ELISA tests.