طراحي و ساخت سازه‌هاي پلاسميدي مختص انتقال هدفمند ژن به ژنوم كلروپلاستي

Designing and construction of specific plasmid constructs for targeted plastome transformation

الحاق ژن خارجي در ژنوم كلروپلاستي از طريق نوتركيبي همتا بين توالي‌هاي مجاور آن ژن در حامل‌هاي كلروپلاستي، رخ مي‌دهد. از آنجايي كه شباهت صد در صدي توالي هدف‌گيري‌كننده كارايي تراريختي پلاستوم را به طور چشمگيري افزايش خواهد داد، يك جفت پرايمر براي جداسازي اين ناحيه طوري طراحي گرديد كه داراي شباهت صد در صدي در تمامي پلاستوم‌هاي گياهي باشد، ولي طول و توالي ناحيه تكثيري در ژنوم‌هاي مختلف متفاوت بود. توالي هدف‌گيري كننده، از پلاستوم‌هاي توتون، پنبه، ذرت، كاهو، گوجه‌فرنگي، هويج و حتي كلزا و ليموترش كه پلاستوم آنها هنوز توالي‌يابي نشده است، جداسازي و كلون‌سازي گرديد. حضور و جهت ناحيه جداشده از پلاستوم گياهان مختلف و صحت كلون‌سازي، توسط آنزيم‌هاي مختلف و از جمله HindIII و BamHI مورد تاييد قرار گرفت. سپس با افزودن نواحي تنظيمي مختلف شامل پيشبرها و پايانبرهاي دايمي كلروپلاستي و القايي، نواحي بدون ترجمه يا UTRهاي مناسب، نواحي اتصال ريبوزوم پلاستيدي، جايگاه‌هاي آنزيمي مناسبِ ورود ژن براي بيان انفرادي و يا پلي‌سيستروني، ژن‌هاي گزارشگر، ژن‌هاي نشانگر انتخابي آنتي‌بيوتيكي و غيرآنتي‌بيوتيكي و توالي‌هايي براي حذف ژن نشانگر پس از انتقال ژن، تلاش شد تا انواع مختلفي از حامل‌هاي كلروپلاستي ساخته شوند تا بتوان بيان هر ژن خارجي را به طور دلخواه در ژنوم‌هاي پلاستيدي گياهان مختلف به صورت كارآمد امكان‌پذير نمود كه سازه‌هاي كلروپلاستي pFNGi، pFNG از جمله آنها بود. اين پلاسميدهاي نوتركيب مي‌توانند به عنوان حامل‌هاي پلاستيدي عمومي و اختصاصي براي انتقال ژن به كلروپلاست استفاده شوند. در اين تحقيق نه تنها براي گياهان مذكور، بلكه براي هر گونه گياهي ديگري كه توالي پلاستومي آن در دسترس نيست نيز حامل پلاستيدي اختصاصي و داراي كارايي بالا تهيه شد.

Integration of foreign genes into plastid genomes occur through homologous recombination between flanking sequences of gene in plastid vectors. In this study, by analysis of plastid genomes using bioinformatics databases, we succeed to select a region of plastome as alien gene targeting sequence including the appropriate length for homologous recombination and integration in plastome, specific plastid origin of replication, targeting gene to inverted repeat region of plastid genome and unique restriction enzymes recognition sites in the center of flanking region sequences for alien gene integration. Since similarity (%) of the flanking region sequences would increase transformation efficiency of plastome dramatically, therefore, a pair of primers was designed to isolate the plastome flanking regions. These primers were100% similar to all plant plastomes, but the length and sequence of their amplified fragments were variable in different plant plastomes. Flanking region sequence from tobacco, cotton, corn, lettuce, tomato, carrot, and even the canola and lemon plastomes that still their plastome sequences are not available in Gene Bank were isolated and cloned. The accuracy of cloning, present and direction of flanking regions fragment from different plant plastomes were confirmed by enzymatic digestion analysis using HindIII and BamHI. Then different types of chloroplastid vectors using different regulation elements were constructed. The regulation elements that could be used for efficient expression of any alien genes in different plastids were including plastid constitutive or inducing promoters and terminators, suitable untraslated regions, Ribosome binding sites of plastid, suitable restriction enzyme recognition sites for cloning and expression of desired gene in single or polycistronic status, reporter genes, antibiotic or non-antibiotic markers and sequences for removing of marker gene. These recombinant chloroplast plasmids including pFNGi and pFNG can be used as universal and specific vectors for chloroplast transformation. Thus, in this study we succeeded to design the high efficient and specific plastid vectors, not only for plants which their plastomes were completely sequenced, but also for other plant species that there is not any sequence of their plastomes availaable in databanks.