استفاده از تكنيك PCR آشيانه اي براي رديابي سريع قارچ Rosellinia necatrix عامل پويسيدگي سفيد ريشه درختان از خاك و ريشه

The Use of Nested PCR Method for Rapid Detection of Rosellinia necatrix Causal Agent of White Root Disease From Soil and Root

بيماري پوسيدگي سفيد ريشه يكي از مهم ترين بيماري هاي درختان ميوه در دنيا و ايران مي باشد كه توسط قارچ Rosellinia necatrix ايجاد مي شود. به منظور رديابي سريع بيمارگر از خاك و ريشه، شش سري خاك از كنار طوقه درختان آلبالو آلوده و دو نمونه خاك به عنوان شاهد منفي و مثبت جمع آوري گرديد. استخراج مستقيمDNA از هشت سري خاك مذكور و ريشه-هاي آلبالو داراي ميسليوم هاي سفيد و خاكستري روي پوست، ريشه هاي داراي ميسليوم هاي بادبزن مانند و ريشه بدون علايم و هم-چنين دو ريشه باقلا (گياه آزمون) داراي ريشه هاي آغشته به ميسليوم روي سطح ريشه و ريشه هاي فاقد علايم صورت گرفت. رديابي بيمارگر از خاك و ريشه با استفاده ازآغازگرهاي اختصاصي R2، R8 و R7، R10 در Nested PCR انجام شد. طبق نتايج به دست آمده، از تمام شش سري خاك، ريشه هاي آلبالوي داراي ميسليوم هاي سفيد و خاكستري و ميسليوم هاي باد بزن مانند و ريشه هاي باقلا داراي علايم، بيمارگر رديابي شد. رديابي قارچ از ريشه هاي بدون علايم در مورد هر دو ميزبان امكان پذير نشد. در ادامه توالي ناحيه ITS جدايه مورد آزمايش تكثير، همسانه سازي و تعيين توالي نوكليوتيدي گرديد. نتايج هم رديف سازي توالي مورد نظر با توالي R. necatrix ثبت شده موجود در بانك ژن نشان داد كه جدايه به دست آمده از خاك حداكثر شباهت (99/98%) را با جدايه شناخته شده R. necatrix دارد. با توجه به يافته هاي اين پژوهش به نظر مي رسد تكنيك Nested PCR توانايي خوبي در رديابي سريع و مقادير كم قارچ در خاك هاي آلوده و ريشه گياهان را دارد.

Abstract White root rot disease, caused by Rosellinia necatrix is one of the most important disease of fruit trees in Iran and worldwide. To detect the pathogen from soil and root, six infected soil samples were collected from cherry crown trees and two samples were collected as positive and negative control. DNA Extraction from eight soil samples including infected cherry roots by white cottony mycelium, roots infected by white mycelial fans and symptom less roots and two faba roots, with white cottony mycelium and symptom less root was performed. Detection of the Pathogen was done by two specific primer pairs R2R8 and R7R10 in Nested PCR reaction. The results showed the detection from six infected soil, positive control and in roots colonized by white cottony mycelium and roots by white mycelial fans and faba roots colonized by white cottony mycelium. No detection was achieved from symptom less roots. To verify the accuracy of the used detection method, ITS region was amplified and cloned in pTZ57R/T vector and sequenced. Comparison of the sequence showed %98.99 similarities to the recognized isolate of R. necatrix. According to our findings, it seems that Nested PCR method could be useful to rapid detection of R. necatrix from soil and root of plants in orchards. Keywords: Rosellinia necatrix, Nested PCR, White root rot, Detection