تهيه سازه‌هاي مناسب به منظور بيان ژن اينترفرون گاماي انساني در Leishmania tarentolae

Development of expression constructs for production of human recombinant IFNγ in Leishmania tarentolae

مقدمه و هدف: افزايش كاربردهاي درماني براي اينترفرون گاماي انساني نوتركيب (hrIFNg) كه يك سايتوكين پيش التهابي ضدويروسي است، موجب گسترش روش هاي بهينه سازي توليد آن شده است؛ در اين مطالعه، توليد اين گليكوپروتيين در سيستم يوكاريوتي تك سلولي Leishmania tarentolae كه از مارمولك tarentolae annularis به دست مي آيد، براي بيان ژن هترولوگ مورد بررسي قرارگرفته است. مواد و روش ها: به منظور تكثير cDNA ژن IFNg از روش RT-PCR روي سلول هاي تك هسته اي خون محيطي تحريك شده با فيتوهماگلوتينين يك فرد ايراني سالم استفاده شد و به منظور بيان پروتيين hrIFNg، cDNA تكثيرشده در دو كاست بياني كلون شد. به نحوي كه هر كاست بياني داراي يك كپي از ژن hIFNg بود؛ اين كاست هاي بياني با روش الكتروپوريشن در جايگاه ژن RNA ريبوزومي (ssu) L. tarentolae وارد شدند. پس از ترانسفورم، كلون هاي ترانسفورم شده در حضور آنتي بيوتيك هاي اختصاصي انتخاب شدند. نتايج: سازه هاي مورد نياز بيان اينترفرون گاماي انساني در سلول هاي L. tarentolae تهيه و به داخل سلول انگل وارد شد و كارايي سازه ها، با تكنيك وسترن بلات تاييدشد. نتيجه گيري: تاكنون انواع مختلفي از سلو ل هاي پروكاريوتي و يوكاريوتي به عنوان سيستم هاي بياني در توليد پروتيين هاي نوتركيب استفاده شده اند ولي به دليل ويژگي هايي، اغلب در بيان اين گليكوپروتيين ناموفق بوده اند. سيستم به كار رفته در اين مطالعه از خصوصياتي ويژه ازقبيل سرعت رشد بالا، شرايط كشت ارزان و گليكوزيلاسيون مناسب گليكوپروتيين ها بهره مند است كه مي تواند براي توليد پروتيين نوتركيب به كاررود.

Background and Objective: The aim of the present study was to express recombinant human interferon-gamma in Leishmania tarentolae. The Leishmania expression system represents the combination of easy handling known from bacterial expression systems with the potential of a eukaryotic protein expression, folding and modification system. The trypanosomatid protozoan host Leishmania tarentolae was isolated from lizard and is not pathogenic to mammals. Materials and Methods: In this study, two constructs were developed for expression of recombinant human interferon-gamma (hrIFNg) in L. tarentolae. Each one of constructs carries an antibiotic resistant gene such as Hygromycin and Nourseothericin. For high level expression of the human interferon-gamma, developed DNA cassette that contains interferon-gamma (IFNg) cDNA was designed to integrate into a genomic small subunit rRNA locus of L. tarentolae by homologous recombination. Results: The integration of the expression cassette into the ssu locus was confirmed by diagnostic PCR of the genomic DNA of transgenic strain. Conclusion: Although it has been shown that E. coli might be considered as a suitable host with a relatively high level of expression and lack of posttranslational modifications and the need for refolding stages are still big challenges. In contrast, L. tarentolae is eukaryotic gene expression machinery, which includes full glycosylation and disulfide bond formation, and thus represents a potential advantage over other expression systems. These facts confirm that the gene expression system using Leishmania parasites combines many of the advantages of both prokaryotic and eukaryotic expression systems.