ساخت يك سازه بهينه شده لنتي ويروسي نوتركيب حاوي ژن pdx-1 براي انتقال ژن به سلول‌هاي بنيادي در راستاي ژن درماني ديابت نوع 1

Construction Of An Optimized Lentiviral Vector Containing Pdx-1 Gene For Transduction Of Stem Cells Towards Gene Therapy Diabetes Type 1

زمينه و هدف: امروزه بسياري از پروتكل‌هاي ژن درماني با حامل هاي لنتي ويروسي انجام مي شود. يكي از مهم‌ترين فاكتورهايي كه در تكوين پانكراس و رونويسي ژن انسولين نقش دارد فاكتور رونويسي Pancreatic & duodenal homeobox 1 (Pdx-1) است. هدف از اين مطالعه بهينه‌سازي سازه لنتي ويروسي حاوي ژن pdx-1 براي ترانسفكشن سلول‌هاي بنيادي در راستاي ژن درماني ديابت نوع 1 بود. روش بررسي: در اين مطالعه تجربي ابتدا ژن pdx-1 از حامل pcDNA3.1-pdx-1به وسيله PCR تكثير و در حامل pTG19–Tكلون شد. سپس ژن pdx-1 در بالا دست ژن IRES–EGFPدر حامل pIRES2–EGFP ساب كلون شد. در مرحله بعد قطعات كلون شده‌ IRES–EGFP و نيز pdx-1 با هضم آنزيمي ‌از حامل مربوطه جداسازي و به درون سازه ي بياني لنتي ويروسي pSINTREM در بالا دست ژن TRE-CMVكلون شدند. سازه‌ي نهايي پس از تعيين توالي به سلول‌هاي HEK293 ترانسفكت شد و بيان ژن pdx-1 به وسيله آناليز فلوسايتومتري و ميكروسكوپ معكوس فلورسنت ارزيابي شد. يافته‌ها: نتايج فلوسايتومتري و نيز مشاهده مستقيم با ميكروسكوپ معكوس فلورسنت، نشانگر تاييد بيان ژن‌هاي pdx-1 و GFP در سلول‌هاي HEK293 ترانسفكت شده با سازه نوتركيب نهايي بود. نتيجه‌گيري: با توجه به اين كه سازه حاضر به منظور تضمين بيان طولاني مدت با بازدهي بالا در سلول‌هاي بنيادي طراحي شده و از سامانه ي القايي Tet onهاي در آن استفاده شد، مي‌تواند يكي از بهترين سازه‌ها در جهت انتقال هر نوع ژن به سلول‌هاي بنيادي باشد.

Background & aim: Nowadays, most of gene therapy protocols are performed by lentiviral vectors. One of the most important factors which is involved in pancreas development and transcription of insulin gene is pancreatic & duodenal homeobox 1 (PDX-1) transcription factor. The goal of this study was to optimize a lentiviral construct, containing pdx-1 gene, to transfect stem cells towards gene therapy of type-1 diabetes. Methods: In this experimental study, first, the pdx-1 gene was multiplied by PCR from pcDNA3.1-pdx-1 and cloned into pTG19-T vector. Then, pdx-1 was subcloned on upstream of IRES-EGFP gene into IRES2-EGFP vector. At the next step, the cloned parts of IRES-EGFP and pdx-1 were isolated and cloned into the lentiviral expression vector pSINTREM in upstream of TRE-CMV gene. After sequencing, final construct was transfected into HEK 293 cells and gene expression of pdx-1 was evaluated using flow cytometry analysis and reverse fluorescent microscopy. Results: Flow cytometry results and inverted fluorescent microscopy observing showed that pdx-1 and GFP genes are expressed in cells transfected with final recombinant construct. Conclusion: Regarding the design of this construct, to ensure long time expression with higher in vivo and in vitro expression efficiency for stem cells and also use of Tet on induced optimized system, it seems that the current construct can be among the best ones to transfect stem cells. Key words: Gene therapy, Diabetes, Stem cells