عواقب ژنتيكي پاساژ هاي متوالي در سلول هاي بنيادي مزانشيمال انساني

The Genetic Effects of Aging on Human Mesenchymal Stem Cells through Consecutive Subcultures

مقدمه و هدف: سلول هاي بنيادي بوسيله دو ويژگي منحصر بفرد خود مشخص مي شوند. يكي از آن ها قدرت تكثير بالا و ديگري توانايي تمايز به بافت هاي مختلف است. هر روز در سراسر دنيا از جمله در ايران نتايج كار هاي جديد منتشر مي شود كه نشان دهنده رشد فزاينده كار روي موضوع درمان بكمك سلول هاي بنيادي است. كار با سلول هاي بنيادي با منشا هاي گوناگون، از جمله سلول هايي با منشا جنيني و بالغ ( مانند مغز استخوان، ريشه دندان، بند ناف و غيره) در حال انجام و پيشرفت است. هدف از انجام اين مطالعه روشن نمودن ابقا و پايداري مواد ژنتيكي سلول هاي بنيادي مزانشيمال انساني در طي كشت هاي متوالي در شرايط آزمايشگاهي دانشگاه علوم پزشكي همدان بود. روش كار: در يك مطالعه تجربي، بند ناف به عنوان يك منبع غني از سلول هاي بنيادي انساني به كار گرفته شد. سلول هاي بنيادي استخراج شده پس از رشد و تكثير، تعدادشان زياد شده و كف ظرف هاي كشت را در كشت هاي متوالي پر نمودند. در نتيجه انجام كشت هاي متوالي موفقيت آميز، سلول ها پير شدند و اين موضوع كه احتمالا موجب آسيب هاي ژنتيكي مي شود بوسيله تكنيك كامت قابل شناسايي است. با استفاده از اين تكنيك، كشت هاي اوليه يا جوان (كشت هاي شماره 1 تا 5)، كشت هاي با عمر متوسط (كشت هاي شماره 8 تا 12) و كشت هاي پير (كشت هاي شماره 15 تا 18) با يكديگر مقايسه شدند، همچنين كاريوتيپ سه گروه فوق الذكر، به كمك تكنيك هاي رنگ آميزي ساده و نواري تهيه و با هم مقايسه گرديدند. اسلايد هاي ميكروسكپي متعددي از هر پاساژ تهيه گرديد و سپس 20 سلول به طور اتفاقي از اسلايد هاي مربوط به هر گروه انتخاب شدند. در همه سلول هاي انتخاب شده، آسيب هاي ژنتيكي بررسي شدند و شدت آسيب ها به كمك روش استاندارد از صفر تا چهار شماره گذاري گرديدند. ميانگين شماره هاي داده شده در سه گروه با استفاده از روش غير پارامتريك كروسكال- واليس مقايسه و مورد بحث قرار گرفتند. نتايج: ميانگين سه گروه جوان، مياني و پير به ترتيب 4/0 ، 8/2 و 6/3 بود. كاريوتيپ هاي آماده شده مربوط به كشت هاي اوليه از نظر ساختماني و تعداد نرمال و كشت هاي مسن تر غير طبيعي بودند. نتايج نشان دادند كه پديده پيري و عواقب آن از جمله آسيب مواد ژنتيكي بايد در كار با سلول هاي بنيادي در كشت هاي متوالي در نظر گرفته شوند. نتيجه نهايي : از سلول هاي بنيادي مزانشيمال گرفته شده از خون بند ناف انسان در شرايط آزمايشگاهي همدان ، تنها آن هايي قابل استفاده براي كارهاي پژوهشي هستند كه مربوط به كشت هاي جوان (زير كشت شماره پنج)بودند. توصيه مي شود كشت هاي بالاتر از شماره پنج تنها براي اهداف آموزشي بكار روند و بهتر است كاري مشابه با اين طرح در اين گونه آزمايشگاه هاي تحقيقاتي انجام شود.

Introduction & Objective: Stem cells are determined by their unique features. One of them is high proliferation ability and the other is potency of differentiation to various tissues. The results of new works in various countries around the world including Iran show the growing momentum of works on stem cell therapy. Working with stem cells from different origins including the cells originated from fetal and adult origin (such as bone marrow, dental root, cord , etc)is in progress. The goal of this work was to clear the maintenance and stability of genetic materials of human mesenchymal stem cells through consecutive subcultures in our lab conditions in Hamadan Uni-versity of Medical Sciences. Materials & Methods: In an experimental work, human umbilical cord was used as a rich source of stem cells. Isolated stem cells, after proliferation phase, increased and filled the bottom of the flasks in consecutive passages. After some successive consecutive subcultures, stem cells aged and this may cause damages to genetic material that is evaluated in primary passages (passages number 1-5), middle passages (passages number 8-12) and late passages (passages number 15-18) by the single cell gel electrophoresis assay (comet assay). Also their karyotypes were ex-amined; Solid technique and G-banding staining for chromosome analysis in the stem cells were employed. Several microscopic slides from each passage were prepared. Then 20 cells were ran-domly selected from the slides related to each group. In all selected cells, damages were exam-ined and their degree of damages were scored based on the standard patterns, from 0 to 4. The averages were compared by Kruskal–Wallis test in different groups. Results: Average scores related to three studied cell groups, primary, middle and late passages, were 0.4, 2.8 and 3.6, respectively. Prepared karyotypes from the cells belonging to passages 1-5 were normal but in the aged passages they were abnormal numerically and structurally. Our re-sults showed that the aging phenomenon and its consequences such as DNA damages should be considered in the work with consecutive passages of stem cells. Conclusion : We concluded that in our laboratory conditions, the stem cells taken from human umbilical cord blood are only usable for research purposes in early passages (below passage five).We recommend using passages more than five only for educational purposes in our labora-tory; and it is better to do the same work in such research centers. (Sci J Hamadan Univ Med Sci 2013; 20 (1):32-37)