ترانسفورماسيون برنج (Oryza sativa L.) با ژن‌هاي گزينشگر هايگرومايسين (hpt) و گزارشگر بتاگلوكورونيداز(gus) به روش In planta

Transformation of rice (Oryza sativa L.) using hygromycin (hpt) selector and B-glucuronidase (gus) reporter genes by in planta method

گيـاهان تراريختـه اغلب به وسيله روش هايي بر پايه كشت بافت توليد مي شوند كه روش هاي پيچيـده اي بوده و نياز به آماده سـازي و انتخـاب دقيق ريزنمونه، انتخاب بافت هاي تراريخت شده و باززايي گياهان تراريخته در شرايط in vitro را دارند. در اين آزمايش، گياهان تراريخته در شرايط غير استريل توليد شدند. بدين منظور بذور دو رقم برنج بومي تيپ اينديكا خيسانده شدند تا جنين فعال و شروع به رشد كند. سپس منطقه جنيني با حداقل آسيب به جنين زخم‌زني و با دو سويه اگروباكتريوم تومه فاشيينس (Agrobacterium tumefaciens) حامل ناقل pCAMBIA1105. 1R تلقيح شدند. القا ژن‌هاي vir در محيط كشت خاصي كه بدين منظور طراحي شده است انجام شد. بذور بعداً جوانه‌زده و در تحت شرايط غير استريل رشد كردند. تاييد الحاق ژن انتقالي به درون ژنوم گياهان تراريخته نسل T0 و T1 با استفاده از روش PCR شامل دو ژن در داخل منطقه T-DNA، مقاومت بافت برگي به آنتي‌بيوتيك هايگرومايسين و آزمون بافت شيميايي GUS انجام شد. بيشترين كارايي ترانسفورماسيون در نسل T0 مربوط به تيمار زخم‌زني به وسيله خراش با اسكالپل آغشته به اگروباكتريوم به ميزان 72/11 درصد در رقم هاشمي 75/9 درصد بوده است. كارايي ترانسفورماسيون در رقم هاشمي در شرايط سوزن‌زني همراه با خلا نيز به طور معني‌داري از تلقيح تحت شرايط غيرخلا بيشتر بوده است. به منظور بررسي پايداري ژن تراريخته گياهان نسل T1 به طريق مشابه نسل T0 آناليز مولكولي شده و نتايج نشان داد كه همچنان 19 درصد گياهان نسل T1 تراريخت بوده‌اند.

Transgenic plants are often produced by tissue culture-dependent methods that require careful preparation and selection of explants, selection of transformed cells and regeneration of transgenic plants. In this in planta transformation method, the mature embryos of soaked seed were pierced by an Agrobacterium tumefaciens -coated needle or scalpel. The inoculated seeds were germinated and grew under no sterile conditions. In order to evaluate the effects of cultivars (Hashemi and Gerdeh), A. tumefaciens strains (EHA105 and LBA4404) and Three methods of inoculation (0. 5 mm ? needle, 0. 5 mm ? needle together with vacuum infiltration, Wounding with a scalpel) on transformation efficiency. A CRD based factorial experiment with three replications was applied. Integration of the transgene into the genome of transformed plants (T0 and T1) was confirmed using PCR method, resistance of leaf tissues to hygromycin and histiochemical GUS assay. Accordingly, the highest significant transformation efficiency (11. 72 %) was obtained in Hashemi cultivar wounded with a scalpel. Transformation efficiency of the same cultivar inoculated by a needle under vacuum infiltration was significantly higher than treatment of inoculation in the absence of vacuum. Seventy T0 seedlings were selected randomly and analysed further at T1 generation, which ~19% confirmed to be positive.