كلون و بيان ژن رسپتور ويتامين B12 (btuB) از باكتري E. coli O157 H7

Cloning & Expression of gene for the vitamin B12 receptor in E. coli O157:H7

ژن btuBاز باكتريE. coli O157:H7 از 1845 جفت باز تشكيل شده است. اين ژن پروتيين BtuB را كد مي‏كند كه پروتيين انتقال‏دهنده‏ي ويتامين B12ناميده مي‏شود. پروتيين BtuBبراي جذب كوبالامين در باكتري E. coli ضروري است. اين انتقال دهنده داراي دو بخش است: بخش بشكه‏ي بتا و بخش توپي. بخش توپي كانال بشكه‏ي بتا را مسدود مي‏كند. ويتامين B12 در حضور كلسيم با گرايش زياد به پروتيين BtuB جذب مي‏شود. لوپ‏هاي خارج سلولي L2 و L3 به ويتامين B12 متصل مي‏شوند. ژن كدكننده‏ي پروتيين BtuB از باكتري E. coli O157:H7 تكثير گرديد. اين ژن بصورت پروتيين واجد His (6) –tagged در انتهاي C كلون و بيان گرديد. ژن btuB با طراحي پرايمر ويژه با PCR تكثير مي‏شود. محصول PCRو وكتور انتخابي با آنزيم‏هاي تحديدي برش و به هم متصل مي‏شوند و توليد سازه‏اي (Construct) را مي‏كنند كه به ميزبان DE3) E. coli BL21( انتقال مي‏يابند (Transformation)، سپس سلول‏هاي ترانسفورم شده پس از القا با IPTG و پس از آناليز SDS-PAGE كل پروتيين فقط يك باند مشخص با وزن مولكولي KDa 66 را آشكار كرد. با خالص‏سازي پروتيين BtuB وزن مولكولي دقيق آن معين گرديد. با توجه به اينكه اين پروتيين داراي لوپ هاي خارج سلولي فراواني مي باشد از اين رو يكي از اهداف اين پژوهش توليد و شناسايي پروتيين اتصالي پري پلاسمي انتقال دهنده ويتامين B12 (BtuB) از باكتريE. coli O157:H7 و هدف ديگر تعيين وزن دقيق مولكولي پروتيين BtuB است.

The btuB gene of E. coli O157:H7 is made up of 1845 base pairs. This gene codes BtuB protein that is called vitamin B12 transporter. BtuB protein is necessary for absorbing vitamin B12 in E. coli. This transporter has two domains: The outer membrane B barrel domain and plug domain. The plug domain blocks B barrel channel. Vitamin B12 in presence of calcium is absorbed to BtuB with high affinity. Extracellular loops L2 and L3 bind to vitamin B12. The gene coding for BtuB protein from E. coli O157:H7 was amplified. This gene was cloned and expressed as C-terminal His (6) -tagged protein. btuB gene by designing special primer reproduced with PCR. PCR product and selected vector cutting with limited enzyms and connected together and produce construct which transformed to E. coli BL21 (DE3). Then, transformed cells after induction with IPTG detect just one band with molecular weight about 66 KDalton which indicates BtuB protein molecular weight. The SDS-PAGE analysis of the total protein revealed only 1 distinct bands, with molecular masses of 66 kDalton. purification of BtuB helped reveal its appropriate molecular mass. Regarding to this issue that protein has many Extracellular lopes, therefore, One of the purpose of this study was producing and recognizing periplasmic connecting protein of (BtuB) B12 vitamin transferred of E. coli O157:H7 and the other purpose is determination of proper molecular weight of BtuB protein.