جداسازي، شناسايي و تعيين بيوتيپ يرسينيا انتروكوليتيكاي بيماري زا از شيرهاي پاستوريزه

Isolation, identification and biotyping of virulent Yersinia enterocolitica from pasteurized milk

به منظور بررسي وجود سويه هاي بيماري زاي يرسينيا انتروكوليتيكا در شير پاستوريزه، طي سال 1390 تعداد 242 نمونه شير پاستوريزه عرضه شده در تبريز جمع آوري گرديد. نمونه ها در محيط PSBB غني سازي شد و از ژن هاي ail و virFبه عنوان توالي-هاي هدف براي رديابي سويه هاي بيماري زاي يرسينيا انتروكوليتيكا در نمونه هاي غني شده استفاده گرديد. از نمونه هاي مثبت در آزمايش PCR در محيط CIN آگار وMacConkey آگار كشت داده شد و پرگنه هاي مشكوك با duplex-PCR تاييد گرديد. جهت تعيين بيوتيپ يرسينيا انتروكوليتيكا، جدايه باكتري به وسيله آزمون هاي بيوشيميايي مورد ارزيابي قرار گرفت. همچنين شمارش تعداد باكتري هاي شاخص بهداشتي و آزمون كيفي فسفاتاز قليايي (ALP) بر روي نمونه هاي شير پاستوريزه انجام يافت. يرسينيا انتروكوليتيكاي بيماري زا در 61/6% (16 نمونه) از نمونه هاي شير پاستوريزه با روش ail-PCR رديابي گرديد. در حالي كه 13/4% (10 نمونه) از نمونه ها با روش virF-PCR مثبت تشخيص داده شد. از بين نمونه هاي مثبت در آزمايش PCR، فقط 41/0% (1 نمونه) به وسيله كشت جداسازي و با duplex-PCR تاييد گرديد. بر اساس آزمايش هاي بيوشيميايي، جدايه يرسينيا انتروكوليتيكا از نوع بيوتيپ 4 تعيين گرديد. طبق نتايج مطالعه، 57/11% (28 نمونه) از نمونه هاي شير پاستوريزه ALP مثبت بودند و تعداد باكتري-هاي شاخص بهداشتي در اين نمونه ها در قياس با نمونه هاي ALP منفي تفاوت معني دار (01/0 > p) نشان داد. با توجه به حساسيت زياد يرسينيا انتروكوليتيكا نسبت به حرارت پاستوريزاسيون، لذا آلودگي ثانويه مي تواند دليل اصلي حضور يرسينيا انتروكوليتيكاي زنده در شير پاستوريزه باشد.

In order to investigate the presence of virulent Yersinia enterocolitica in pasteurized milk, 242 samples were collected from Tabriz retails from 2011 to 2012. The samples were enriched in PSBB. Afterwards, virF and ail genes were exploited as target sequences for the detection of virulent Y. enterocolitica. PCR-positive samples were cultured on CIN agar and MacConkey agar. The selected isolates were confirmed by second-phase duplex PCR. For the biotyping of Y. enterocolitica, certain biochemical tests were performed on the isolate. The pasteurized milk samples were further analyzed for the enumeration of hygiene indicator bacteria and qualitative alkaline phosphatase (ALP) test. Virulent Y. enterocolitica were detected in 6.61% (16/242) of samples by ail-PCR, however, using virF-PCR 4.13% (10/242) of the samples were identified as positive. Among PCR-positive samples only 0.41% (1/242) were isolated by culture method and confirmed by second-phase duplex-PCR. Based on the biochemical assays, the isolated Y. enterocolitica was identified as biotype 4. Furthermore, 11.57% (28/242) of the samples were found positive for alkaline phosphatase test. The results revealed that the number of hygiene indicator bacteria in ALP-positive samples was significantly (p < 0.01) higher than ALP-negative samples. Since Y. enterocolitica is very susceptible to pasteurization process, cross contamination could be the main reason for the presence of virulent Y. enterocolitica in the pasteurized milk.